单核细胞趋化蛋白1诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡

《单核细胞趋化蛋白1诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、单核细胞趋化蛋白1诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡【关键词】单核细胞化学吸引蛋白质1；脐静脉；内皮细胞；动脉硬化；细胞凋亡　　动脉粥样硬化(As)与血管内皮细胞（VEC）之间的关系密切，目前被普遍接受的“损伤反应”学说［1］认为，内皮细胞功能性的损伤是As形成早期的始动环节.有学者认为内皮细胞的凋亡在As的早期扮演了重要角色［2］.单核细胞趋化蛋白1（MCP1）是一种趋化激活剂，可以特异地作用于血液中的单核细胞，招引其迁移至内皮下形成泡沫细胞.Selzman等［3］及官秀梅等［4］的研究发现，MCP1不仅有趋化作用，而且

2、可以作为一种生长因子促进血管平滑肌细胞的增殖，从而直接或间接地参与了As的形成，但MCP1对与As发生关系极为密切的内皮细胞的生长有何影响尚少见相关报道，我们对此进行了研究.　　1材料和方法　　1.1材料　　人MCP1（Peprotech公司）；M199培养基，胎牛血清（Gibco公司）；胰蛋白酶，Ⅱ型胶原酶，EDTA（Sigma公司）；AnnexinVEGFP细胞凋亡检测试剂盒，DNAladder检测试剂盒（Oncogene公司）；鼠抗人Ⅷ因子抗体、鼠抗人内皮细胞生长因子受体2(KDR)抗体（美国Dako公司）；超净

3、台（苏州苏净集团安泰空气公司）；倒置相差显微镜（日本Nikon公司）；CO2孵箱（美国ThermoFormo公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；凝胶成像系统（英国Syngene公司）.　　1.2方法　　1.2.1人脐静脉内皮细胞（hUVEC）培养　　采用李琴山等［5］改良的酶消化法进行细胞培养，用内皮细胞特异性Ⅷ因子抗体（抗von199培养基，2mmol/LL谷氨酰胺；实验组（M1~M4组）：MCP1含量分别为0.1，1.0，10，100μg/L.　　1.2.3AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测　　早期凋亡率将h

4、UVEC以1×106个/瓶接种于50mL无菌的培养瓶中，孵育24h后用含10mL/L胎牛血清的M199同步化12h后换为不同终浓度的MCP1应用液，24，48h后用流式细胞仪检测早期凋亡率.　　1.2.4琼脂糖凝胶电泳检测　　DNAladder将hUVEC以1×106个/瓶接种于50mL无菌的培养瓶中，孵育24h后用含10mL/L胎牛血清的M199同步化12h后换为不同终浓度的MCP1应用液，24，48h后按试剂盒说明书提取DNA，15g/L琼脂糖凝胶电泳.电压5V/cm，电泳2.5h.在凝胶成像系统上观察结果并拍照.

5、　　统计学处理：所有数据用SPSS11.0统计软件进行单因素方差分析及t检验，结果用x±s表示.　　2结果　　2.1细胞培养与鉴定　　培养的细胞在显微镜下观察，细胞呈典型的“铺路石”样结构特征（图1）.Ⅷ因子mAb免疫细胞化学结果显示95%为阳性血管内皮细胞，细胞胞质为棕黄色.GAMFITC绿色荧光显示膜上KDR（AntiVEGFrecepter2）和GARTR红色荧光显示胞内的Ⅷ因子，免疫荧光双标显示95%以上为阳性血管内皮细胞.证明所培养的细胞为血管内皮细胞，并且纯度符合实验要求.　　2.2AnnexinV/P

6、I双染流式细胞仪分析　　在0.1μg/LMCP1作用VEC24h即可明显诱导hUVEC的早期凋亡，这种效应随MCP1用量增加和作用时间的延长而明显增强（P<0.01，表1）.表1不同浓度的MCP1作用hUVEC24，48h后AnnexinV/PI检测早期凋亡（略）　　2.3MCP1对hUVEC作用　　后琼脂糖凝胶电泳在1.0μg/L的MCP1作用24，48h时均未见“DNAladder”，而10μg/L和100μg/L的MCP1作用于hUVEC24，48h后均可见“DNAladder”（图2）.说明MCP1

7、作用于hUVEC可引起凋亡，并且具有剂量依赖性.　　我们用不同浓度MCP1作用于原代培养的hUVEC（于人体、更接近于体内细胞的生理特性）24，48h，观察其对VEC生长的影响.细胞发生凋亡时，由于内源性钙－镁离子依赖性核酸內切酶被激活，选择性降解核小体间DNA，形成大小不一的DNA片段，在琼脂糖凝胶电泳上呈现规则的、间隔180～200bp的DNA梯带，即“DNAladder”,而坏死细胞DNA断裂无规律性.“DNAladder”已被认为是判定细胞凋亡的金标准之一［10］.此外，细胞发生凋亡时胞膜成分亦发生改变.在凋亡早期

8、,原来位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine,PS)迁移至脂双层外侧，PS外翻是凋亡细胞的早期事件.AnnexinV是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合.与PI双染细胞通过流式细胞仪可区分活细胞、凋亡细胞及坏死细胞.两项指标检测的结果均表明MCP1能