单核细胞趋化蛋白1诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡

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1、单核细胞趋化蛋白1诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡【摘要】目的：研究单核细胞趋化蛋白1（MCP1）对人脐静脉内皮细胞(hUVEC)凋亡的影响.方法：培养并鉴定hUVEC；用不同浓度MCP1（0.1,1.0,10,100μg/L）对其作用24，48h；AnnexinV/PI双染细胞，流式细胞仪观察内皮细胞凋亡；琼脂糖凝胶电泳检测细胞染色体“DNAladder”的形成.结果：MCP1能诱导hUVEC的凋亡，其效应随浓度和时间的增加而增强(P0.01)；AnnexinV/PI显示凋亡细胞明显增加；细胞DNA呈明显的“DNAlad

2、der”.结论：MCP1能诱导hUVEC凋亡.【关键词】单核细胞化学吸引蛋白质1；脐静脉；内皮细胞；动脉硬化；细胞凋亡　　动脉粥样硬化(As)与血管内皮细胞（VEC）之间的关系密切，目前被普遍接受的“损伤反应”学说〔1〕认为，内皮细胞功能性的损伤是As形成早期的始动环节.有学者认为内皮细胞的凋亡在As的早期扮演了重要角色〔2〕.单核细胞趋化蛋白1（MCP1）是一种趋化激活剂，可以特异地作用于血液中的单核细胞，招引其迁移至内皮下形成泡沫细胞.Selzman等〔3〕及官秀梅等〔4〕的研究发现，MCP1不仅有趋化作用，而且可

3、以作为一种生长因子促进血管平滑肌细胞的增殖，从而直接或间接地参与了As的形成，但MCP1对与As发生关系极为密切的内皮细胞的生长有何影响尚少见相关报道，我们对此进行了研究.　　1材料和方法　　1.1材料　　人MCP1（Peprotech公司）；M199培养基，胎牛血清（Gibco公司）；胰蛋白酶，Ⅱ型胶原酶，EDTA（Sigma公司）；AnnexinVEGFP细胞凋亡检测试剂盒，DNAladder检测试剂盒（Oncogene公司）；鼠抗人Ⅷ因子抗体、鼠抗人内皮细胞生长因子受体2(KDR)抗体（美国Dako公司）；超净台（苏

4、州苏净集团安泰空气公司）；倒置相差显微镜（日本Nikon公司）；CO2孵箱（美国ThermoFormo公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；凝胶成像系统（英国Syngene公司）.　　1.2方法　　1.2.1人脐静脉内皮细胞（hUVEC）培养　　采用李琴山等〔5〕改良的酶消化法进行细胞培养，用内皮细胞特异性Ⅷ因子抗体（抗von199培养基，2mmol/LL谷氨酰胺；实验组（M1~M4组）：MCP1含量分别为0.1，1.0，10，100μg/L.　　1.2.3AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测　　早期凋亡率将hUVEC以

5、1×106个/瓶接种于50mL无菌的培养瓶中，孵育24h后用含10mL/L胎牛血清的M199同步化12h后换为不同终浓度的MCP1应用液，24，48h后用流式细胞仪检测早期凋亡率.　　1.2.4琼脂糖凝胶电泳检测　　DNAladder将hUVEC以1×106个/瓶接种于50mL无菌的培养瓶中，孵育24h后用含10mL/L胎牛血清的M199同步化12h后换为不同终浓度的MCP1应用液，24，48h后按试剂盒说明书提取DNA，15g/L琼脂糖凝胶电泳.电压5V/cm，电泳2.5h.在凝胶成像系统上观察结果并拍照.　　统计学处理

6、：所有数据用SPSS11.0统计软件进行单因素方差分析及t检验，结果用x±s表示.　　2结果　　2.1细胞培养与鉴定　　培养的细胞在显微镜下观察，细胞呈典型的“铺路石”样结构特征（图1）.Ⅷ因子mAb免疫细胞化学结果显示95%为阳性血管内皮细胞，细胞胞质为棕黄色.GAMFITC绿色荧光显示膜上KDR（AntiVEGFrecepter2）和GARTR红色荧光显示胞内的Ⅷ因子，免疫荧光双标显示95%以上为阳性血管内皮细胞.证明所培养的细胞为血管内皮细胞，并且纯度符合实验要求.　　2.2AnnexinV/PI双染流式细胞仪分

7、析　　在0.1μg/LMCP1作用VEC24h即可明显诱导hUVEC的早期凋亡，这种效应随MCP1用量增加和作用时间的延长而明显增强（P0.01，表1）.表1不同浓度的MCP1作用hUVEC24，48h后AnnexinV/PI检测早期凋亡（略）　　2.3MCP1对hUVEC作用　　后琼脂糖凝胶电泳在1.0μg/L的MCP1作用24，48h时均未见“DNAladder”，而10μg/L和100μg/L的MCP1作用于hUVEC24，48h后均可见“DNAladder”（图2）.说明MCP1作用于hUVEC可引起凋亡，并

8、且具有剂量依赖性.　　3讨论　　血管内皮细胞是参与As病理过程的重要细胞，实验证明发生As的局部血管内皮细胞更新加快，提示高频率的内皮细胞凋亡是As发生的第一步〔6〕，凋亡内皮细胞的增加易改变内皮的完整性和功能，从而诱发As〔7-8〕.因此VEC凋亡在As中的作用越来越受到关