泛素蛋白酶体通路在atra诱导白血病细胞分化与周期调控中的作用研究论文

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1、泛素蛋白酶体通路在ATRA诱导白血病细胞分化与周期调控中的作用研究浙江大学药学院07药理专业林美花导师：何俏军教授杨波教授中文摘要研究目的：全反式维甲酸(all-transretinoicacid，ATRA)治疗急性早幼粒白血病(acutepromyelocyticleukemia,APL)能特异性诱导APL细胞分化成熟，具有疗效显著、完全缓解率高、毒副作用小等特点，因此成为临床上治疗APL的首选药物。但至今为止，ATRA诱导细胞分化的作用机制并未得到系统阐述．据文献报道，维甲酸诱导细胞分化过程伴随着明显的周期阻

2、滞现象，同时与细胞分化、周期阻滞密切相关的蛋白均通过泛素一蛋白酶体通路降解．但是，关于泛素．蛋白酶体通路在维甲酸诱导白血病细胞分化中的作用并未见文献报道．本实验主要研究泛素一蛋白酶体通路在全反式维甲酸(ATRA)诱导白血病细胞增殖／分化转变过程中的作用，并探讨其可能的作用机制．研究方法：1)选用人白血病细胞株NB4和HL．60为研究对象，以全反式维甲酸(ATRA)，二甲基亚砜(DMSO)等分化诱导剂处理来评价泛素蛋白酶体通路活性的变化与细胞分化间的相关性；采用血细胞计数板计数来观察细胞增殖情况，描绘细胞生长曲线；

3、细胞经碘化丙锭(PI)染色后采用流式细胞术分析细胞周期的变化情况；细胞经CDllb-PE抗体结合后采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CDllb表达；应用Westernblot检测细胞周期相关蛋白(cyclinDl、cyclinE、CDK2、CDK4、CDK6、pRb)和泛素化蛋白，及20S核心颗粒ot亚基、B亚基的表达；应用Real．timePCR检测细胞内泛素单体mRNA表达水平；采用荧光底物Sue．LLVY-AMC的水解检测细胞内20S蛋白酶体活性。2)以蛋白酶体抑制剂MGl32合用ATRA与单用ATRA处理

4、细胞比较进一步观察UPP在细胞增殖／分化转变过程中作用。采用流式细胞术检测细胞周期变化及细胞表面分化抗原CDllb表达；应用Westernblot检测细胞内-9G1／S时相转换的相关蛋白(cyclinD1、cyclinE、CDK2，CDK4、CDK6、pRb及p-pRb)的表达；应用Real-timePCR检测细胞内关键周期蛋白cyclinE和CDK2mRNA表达水平；应用Co—m和Westernblot检测周期蛋白cyclinE和CDK2同泛素蛋白的结合情况。研究结果：1)通过血细胞计数板计数，显示ATRA(O

5、．1或l州)和ATRA(1或5州)可分别显著抑制NB4和HL．60细胞增殖。流式细胞术分析细胞周期情况，显示ATRA(o．1IlM)和ATRA(5IIM)能使白血病细胞的细胞周期阻滞在G1／G0期，同时诱导了细胞的分化，CDllb的表达率明显增加，都在第3天基本上达到峰值。2)Westernblot检测结果表明，相关周期蛋白cyclinE、CDK2、CDK4、CDK6和pRb均随作用时间增加而下调，并在第3天的时候变化最明显，到第5天时基本上不表达。而eyclinD1却呈相反的变化趋势。说明ATRA诱导细胞周期阻

6、滞同关键周期蛋白的下调是相关的。3)泛素蛋白酶体活性在ATRA诱导的NB4和HL一60细胞分化过程中明显上调。RT-PCR检测结果表明泛素单体UbmRNA的表达是呈时间依赖性增加的，Westernblot检测结果显示多聚泛素蛋白水平是上调的，在第3天达到最大值。20S核心颗粒a亚基、13亚基蛋白量是随作用时间的增加而增加。20S蛋白酶体活性检测结果表明其活性也是呈时问依赖性增加的。4)ATRA处理维甲酸耐受细胞株HL．60R和神经母细胞瘤细胞CHPl26后，及其它的分化诱导剂如DMSO、TPA和1,25(OH)2

7、D3诱导NB4细胞不同类型分化过程中UPP活性变化的检测。Westernblot和20S蛋白酶体活性检测结果显示，ATRA处理HL一60R和CHPl26后，多聚泛素蛋白水平和蛋白酶体活性并未被上调。而在DMSO诱导的粒性细胞分化过程中多聚泛素蛋白水平和蛋白酶体活性都是上调的，并在第2天达到最大值，而TPA和1,25(OH)2D3诱导的单核／巨噬细胞系分TII化过程中两者都没有明显变化，其活性在第3天反而有所下降。上述结果表明UPP活性的变化同细胞的类型及细胞的分化类型是相关的．5)采用蛋白酶体抑制剂MGl32进一

8、步验证UPP在ATRA诱导的细胞周期阻滞和分化过程中的必要性，及其可能的作用机制．流式细胞术结果显示，在药物诱导的NB4细胞中，单用ATRA(0．1IxM)作用72小时后G1／G0期细胞比例为74％，CDllb表达率为70％，而当MGl32和ATRA共同处理后，G1／G0期细胞比例下降到59％，CDllb表达也下调至40％。同样地，在HL．60细胞中也有此现象，采用ATR