cdk2泛素化降解在全反式维甲酸诱导急性髓性白血病细胞分化中作用的研究

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1、浙江大学硕士学位论文中文摘要CDK2泛素化降解在全反式维甲酸诱导急性髓性白血病细胞分化中的作用研究中文摘要浙江大学药学院09级药学硕士研究生：景慧导师：何俏军教授杨波教授研究目的：急性髓性白血病(acutemyeloidleukemia，AML)的重要标志为严重的髓系分化障碍，因此诱导分化治疗是目前公认的针对AML的有效治疗策略。利用全反式维甲酸(a11．transretinoicacid，ATRA)治疗早幼粒细胞白血病(acutepromyeloidleukemia，APL，M3型AML)是诱导分化治疗策略用于临床实践的最成功范例。由于ATRA在临

2、床应用上的巨大成功，深入研究ATRA诱导细胞分化的分子机制，进一步发现诱导分化治疗的潜在靶标，完善诱导分化治疗策略是许多肿瘤学家追求的重要目标。现代分子生物学研究发现ATRA诱导白血病细胞分化过程中往往伴随有细胞退出增殖周期，即细胞周期阻滞于G0／G1期。因此细胞周期调控因子在ATRA诱导分化中的作用成为该领域的研究热点之一。根据现有文献报道，细胞周期蛋白依赖激酶活化激酶(Cyclin-dependentkinase-activatingkinase，CAK)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21WAFl庀妒1、p27KMP和CyclinE等

3、都被认为在ATRA诱导细胞分化过程中发挥重要作用．但细胞周期蛋白依赖激酶(Cyclin-dependentkinases，CDKs)是否在该过程中发挥作用目前仍无文献报道。细胞周期蛋白依赖激酶2(Cyclin．dependentkinase2，CDK2)属于CDK丝氨酸U浙江大学硕士学位论文中文摘要／苏氨酸激酶家族，是细胞G1／S期转换过程中的重要调控因子．CDK2可分别结合于CyclinE和CyclinA，随后CAK磷酸化其苏氨酸160位(Thr-160)而被激活，通过磷酸化众多底物而促进G1／S期的进程。然而除在细胞周期中发挥重要作用外，近年来C

4、DK2也被发现在调控细胞自我更新和分化中起到关键作用。一些文献报道CDK2活性或表达可促进鼠神经母细胞瘤细胞、胚胎干细胞、小鼠中枢神经系统祖细胞和成年小鼠的髓鞘等的分化。泛素蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasomesystem，UPS)是真核细胞内蛋白质选择性降解的重要途径。通过选择性降解并调控细胞内蛋白，UPS广泛地参与细胞的生长、分化、凋亡、周期调控、炎症反应等重要的生命活动过程。本课题组前期研究发现，ATRA诱导AML细胞分化和G0／G1周期阻滞的过程中伴随有CDK2蛋白水平的明显下降，而同时抑制蛋白酶体活性，CDK2下调的趋势被

5、明显逆转，提示CDK2在ATRA作用后可能通过UPS发生降解。关于CDK2的降解机制及其在ATRA诱导细胞分化中的作用目前均尚无文献报道。因此，本课题的研究将分两部分探讨ATRA诱导AML细胞分化中UPS介导的CDK2的降解：1)确证ATRA促进CDK2通过UPS发生降解，并探讨其调控机制；2)研究CDK2降解对ATRA诱导AML细胞分化的影响，并探索相关分子机制。研究方法：1)选用人白血病细胞株NB4和U937为主要研究对象，考察ATRA诱导细胞分化过程中CDK2泛素化降解的情况：细胞经CDllb．PE抗体孵育后采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原C

6、Dllb表达；应用瑞氏．吉姆萨染色观察细胞形态学改变；应用碘化丙啶(propidiumiodide，PI)染色结合流式细胞术检测细胞周期分布；应用Real．timePCR检测细胞中CDK2mRNA水平变化；应用westem．blot检测CDK2及p-CDK2(Thr-160)蛋白水平变化；应用免疫荧光法检测细胞内CDK2与泛素蛋白(Ubiquitin，Ub)的共定位变化；采用免疫沉淀法检测CDK2与Ub的结合水平；选用COS．7细胞为瞬时表达宿主，共转染CDK2／CDK2．T160A和Ub考察CDK2和CDK2．T160A的泛素化降解情况．采用TNT

7、圆兔网织红细胞裂解液转录／翻译偶III浙江大学硕士学位论文中文摘要联系统体外表达CDK2重组蛋白。2)选用人AML细胞株NB4为主要研究对象，考察细胞内CDK2蛋白水平下降对ATRA诱导AML细胞分化作用的影响：采用台盼蓝染色结合血细胞计数板计数观察细胞增殖情况和细胞存活率，描绘细胞增殖曲线；细胞经CDllb．PE抗体孵育后采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CDllb表达；应用瑞氏．吉姆萨染色观察细胞形态学改变；采用硝基四氮唑蓝(NBT)测试细胞还原能力；采用PI染色结合流式细胞术检测细胞周期分布的变化；应用western．blot检测CDK2蛋白，

8、细胞周期蛋白(CyclinE、CyclinA)，分化相关转录因子的表达(p-STATlTry701，STAT