全反式维甲酸诱导神经干细胞向神经元的分化

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1、万方数据万方数据王飞．等÷全反式维甲酸诱导神经于细瞻囱神经元的分纯>>本文导读<<俨’’’一’⋯、⋯“1。j}梁厨孝景，髓廖同济大学缉劈露万层：采用RT．PcR半厨纾炉笏：现有研究已明确维甲酸可促进j‘。青年优秀人才培养行动计划资定量法仅检测了维甲酸受体a神经干细胞向神经元方向分化，但具体机制‘i助，项目编号1508219034，研InRNA的表达，后续实验可深入不清．实验采用耵：P(x半定量法检测维甲i究重点为采用全反式维甲酸诱分析其他亚型的维甲酸受体，并酸受体arnIWA的表达，发现全反式维甲酸：0导体外培

2、养的大鼠胚胎神经干进一步检测维甲酸受体a的蛋对神经干细胞的谤导分化作用是首先与维甲{；细胞分化以及维甲酸受体a白表达情况，以更加确定全反式酸受体a结合，从而启动一系列的细胞信号i；mRNA的表达变化，拟初步认维甲酸对神经干细胞的诱导分传导途径，以促使神经干细胞向神经元分化，：I识全反式维甲酸诱导神经干细化作用是首先与维甲酸受体a实验结果提出了神经干细胞向神经元分化分j；胞分化的分子机制．结合的这一观点。子机制的初步分析．j0引言近年来人类神经干细胞的分离培养为中枢神经系统功能重建和神经再生提供了光明的应用前景【

3、lJ，解决神经干细胞的定向分化问题是其应用于中枢神经系统移植的关键【2。3l。神经元的分化受许多细胞外信号分子的影响，这些分子通过细胞膜受体介导级联反应或核受体介导作用影响早期中枢神经系统的发育降51。脑源性神经营养因子、胰岛素样生长因子能增加表皮生长因子敏感的神经干细胞分化成神经元的数量睁7】。胶质细胞源性神经营养因子、白血病抑制因子能促进神经前体细胞分化成酪氨酸羟化酶阳性神经元【8】。白细胞介素1在多种因子中诱导中脑神经前体细胞分化为酪氨酸羟化酶阳性神经元的作用较吲91。全反式维甲酸是一种作用很强的分化诱导

4、剂，在调控多种组织和细胞的增殖、生长发育、代谢以及维持内环境稳定等方面具有广泛的生物学作用。维甲酸的受体存在于细胞核内，目前已发现两类：维甲酸受体与类维生素Ax受体，二者又均可分为Q、B、Y3种亚型10】。全反式维甲酸只能与维甲酸受体结合，而9．顺式维甲酸既可与维甲酸受体结合，亦可与类维生素Ax受体结合。近年来发现维甲酸能够诱导大鼠脑海马的多潜能细胞分化为神经元【l¨。实验采用全反式维甲酸诱导体外培养的大鼠胚胎神经干细胞，探讨全反式维甲酸对神经干细胞的诱导分化作用及其维甲酸受体QIT氓NA的表达变化。1材料和方

5、法设计：对照观察，细胞学体外实验。时间及地点：于2006—07／2007—06在上海同济大学附属医院实验室完成。材料：普通级孕13．14d雌性SD大鼠6只，体质量26肌340g，由上海实验动物中心提供，动物质量合格证号：SYxK(沪)200昏0009，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。主要仪器与试剂来源H0echst33342，全反式维甲酸DMEM、F12细胞培养基、N2添加剂。碱性成纤维生长因子表皮生长因子小鼠抗大鼠NSElgG、Uln计isi∞免疫组化检测试剂盒FⅡ℃标记的山羊抗小鼠lgGFR．20

6、0电泳图像采集系统，Sm绷Mew电泳图像分析软件SiglIIa公司Gibco公司Bdbioscience公司上海复日科技公司实验方法：神经干细胞的培养：在无菌条件下取sD胎鼠大脑皮质，加入DMEM／F12无血清培养液，轻轻吹打成单细胞悬液，1000r，fnjn离心10Inin，以1×108L_1密度接种于细胞培养瓶，置于37℃、体积分数为0．05的C0：饱和湿度条件下培养，培养液中添加20mg／L表皮生长因子和20mg，L碱性成纤维生长因子。每3d半量换液，每隔7d机械分离神经球进行传代培养。维甲酸诱导神经干细

7、胞分化：取生长状况良好的传第3代神经干细胞用于实验，以2×108L-1密度接种于12孔细胞培养板，细胞培养板中预先放置多聚赖氨酸处理过的无菌玻片。分为全反式维甲酸诱导1d，3d，7d，10d组和空白对照组，各诱导组的全反式维甲酸浓度均为1unlol／L，空白对照组仅加入无菌生理盐水。神经元免疫荧光染色鉴定及细胞计数：诱导后取出各组玻片，进行细胞免疫荧光染色鉴定神经元特异性烯醇化酶。细胞免疫荧光染色结束后，用Hoechst33342(浓度为lg，L)染色，Hoechst33342是双间二氮茚类物质，为特异的DNA

8、染料，其只对细胞核进行染色，故可以用Hoechst33342来确定细胞的总数。在荧光显微镜下随机在每一张玻片上取20个视野(油镜下，l000倍)，计数Hoechst33342染色阳性的细胞核数目及神经元特异性烯醇化酶染色阳性的细胞数，神经元阳性率=神经元特异性烯醇化酶馏oechst33342+。RT．PCR半定量检测黜幔am】怂渔的表达：引物设E0．B以1200．sh删gll∞04I扛