cx26不同结构域错义突变体的表达和定位

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1、听力学及言语疾病杂志2010年第18卷第3期249实验研究CX26不同结构域错义突变体的表达和定位*杨中纯肖自安谢鼎华【摘要】目的探讨cx26蛋白质的9个结构域上的不同错义突变体在细胞内的表达及功能改变的异同，初步研究cx26不同错义突变体的致聋机理。方法在cx26的9个结构域中各选择1个致聋的错义突变(p．s19T、p．R32H、P．E47K、P．V84L、P．V95M、P．R143W、P．R165W、P．s199F、P．L214P)，应用重叠区扩增基因拼接法和长引物快速法，构建成与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的载体，野生型CX26一EGFP作对照，脂质体转染HeLa细胞，Wes

2、ternblot分析蛋白的表达，共聚焦显微镜下观察各突变体在细胞膜上有无间隙连接斑形成。结果CX26的9个结构域上的各1个错义突变体在HeLa细胞中均有表达，其中P．S19T、P．E47K、P．V84I⋯PV95M和P．vR165W突变体能在细胞膜上表达并形成间隙连接斑，P．R32H、P．R143W、P．$199F和P．I214P突变体在细胞浆中表达，在细胞膜无表达，无间隙连接斑形成。结论CX26的p．S19T、P．E47K、P．V84L、P．V95M和P．R165W突变体在细胞内能被转运到细胞膜并形成间隙连接，而P．R32H、P．R143W、P．S199F和P．L214P突变体失去被转运到

3、细胞膜的功能，不能形成间隙连接。CX26的不同错义突变的致聋机制可能不同，与突变点所在的结构域可能没有相关性。【关键词】连接蛋白26(CX26)；突变体；表达；间隙连接DOI：10．3969／j．issn．1006—7299．2010．03．015【中图分类号】R764．5【文献标识码】A【文章编号】1006—7299(2010)03—0249—05TheExpressionsandLocalizationsofNineMissenseMutantsof0X26inHeLaCellsYangZhongchun，XiaoZian，XieDinghua(DepartmentofOtolaryng

4、ology-HeadandNeckSurgery，theSecondXiangyaHospital，CentralSouthUniversity，Changsha，410011，China)[Abstract]ObjectiveToexplorethedeafness-causingunderlyingmechanismsofCX26generecessivemuta—tionsthroughfunctionalanalyzingninemissensemutations(P．$19T，P．R32H，P．E47K，P．V84I，P．V95M，P．R143W，P．R165W，P．S199F，P

5、．L214P)inexogenousexpressionsystemHelacells．MethodsTheninerecessivemissensemutationsofCX26，whichareinthedifferentdomainsofCX26protein，andthewildtypeCX26weresub—clonedintopEGFP—NIvectordirectively，followingtotransfectintoHeLacellsbytheliposomecomplexmethod．Theexpressionsofthemutatedproteinswereanaly

6、zedusingwesternblotmethod．Thelocalizationsofthemutatedproteinsandwhetherthereweregapjunction-plaquesformationwereobservedunderconfocalmicroscopywithim—munoflu0rescencetechnique．ResultsThenineconstructswereallexpressedinHeLacells．Inwhich，themutatedproteinsofP．S19T，P．E47K，P．V84L，P．V95MandP．R165Wlocal

7、izedatthecytoplasmicmembraneofHeIacellsandformedgapjunction-plaquesatcontactpointsbetweentwocells，andthemutatedproteinsofP．R32H，P．R143W，P．$199FandP．L214Paccumulatedandlocalizedonlyintracellularlyanddidnotfo