人类错配修复基因hmlh1和hmsh2错义突变真核表达载体的构建及表达

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1、人类错配修复基因hMLH1和hMSH2错义突变真核表达载体的构建及表达【摘要】目的构建人类错配修复基因hMLH1和hMSH2错义突变真核表达载体并检测它们在瞬时转染细胞中的蛋白表达。方法重组pcDNA3.1-hMLH1-ismatchrepairgene，MMR)发生胚系突变造成的常染色体显性遗传性肿瘤，约占结直肠癌总数的5%～15%[1-2]。HNPCC的发病与人类错配修复基因功能异常密切相关，hMLH1和hMSH2基因突变在HNPCC病人总突变中占90%以上，是导致HNPCC发病的主要原因[3]。在临床诊

2、断上尽管阿姆斯特丹标准对HNPCC的发病特点做了较为明确的描述[4]，但由于HNPCC患者缺乏明显的临床指征，误诊率高，因此HNPCC的确诊还有赖于错配修复基因胚系病理性突变的检出。在hMLH1和hMSH2基因突变谱中，大约三分之一的突变属于错义突变[5-6]。相对于大多数导致截短蛋白的恶性突变，这种单个氨基酸改变的错义突变对蛋白功能的影响往往差异较大，因此对这些错义突变进行功能评估，明确其属于无害突变还是病理性突变，其基因功能是部分受到影响还是完全表达失活，在分子病理学诊断上具有重要意义。鉴于此，本文选择在

3、华人中疑似HNPCC家系中发现的五种错义突变，即hMLH1基因的T117M和V384D以及hMSH2基因的L390F、Q419K和Q629R，采用定点突变技术构建其真核表达载体，并用免疫印迹法和免疫荧光法对转染细胞进行蛋白表达分析，为进一步研究这些错义突变的病因学作用和功能意义，评估其可能的临床意义奠定实验基础。　　1材料和方法　　1.1材料　　人结肠癌LoVo细胞株和HCT-116细胞株均购自美国ATCC(Americantypeculturecollection)。重组质粒pcDNA3.1-hMLH1-博

4、士惠赠。质粒pcDNA3.1+(V790.20)购自美国Invitrogen公司。定点突变试剂盒QuikChangeSite-directedMutagenesiskit购自美国Stratagene公司，质粒提取试剂盒QIAGENMiniprepKit购自德国QIAGEN公司。Fugene6转染试剂购自美国Roche公司。免疫印迹分析所用一抗hMLH1单克隆抗体(Clone：G168-728)和hMSH2单克隆抗体(Clone：27)均购自美国BDBiosciences公司。β-actin抗体(CLONEAC

5、-15)购自美国Sigma公司。二抗辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG，增强型ECL试剂盒和硝酸纤维素膜均购自美国AmershamBiosciences公司。用于免疫荧光分析的二抗AlexaFluor488GtA-MoIgG(H+L)购自美国Invitrogen公司。荧光倒置显微镜为日本的NikonECLIPSETE2000-S。用ABI3130DNA测序仪(美国应用生物系统公司)进行测序。　　1.2细胞系及培养　　LoVo细胞用RPMI-1640培养基，HCT-116细胞用McCoy's5A培养基。

6、培养基含10%胎牛血清、100u·mL-1青霉素和100u·mL-1链霉素。在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。　　1.3表达载体的构建及定点突变　　重组pcDNA3.1-hMLH1-in，68℃延伸8min，经过12个扩增循环后，用限制性内切酶DpnI特异性切除甲基化的模板DNA。将带缺口的突变质粒转化到E.coli.XL1-Blue感受态细胞中，用Amp抗性LB平板筛选阳性克隆，用QIAprepSpinMiniprepKit试剂盒进行质粒提取，用ABI3130DNA测序仪进行测序以验证是否正确引

7、入预期突变并冻存剩余菌液。　　1.4转染　　以hMLH1基因野生型及两种错义突变的真核表达载体分别转染HCT-116细胞，以hMSH2基因野生型及三种错义突变的真核表达载体分别转染LoVo细胞。在转染前1d，用无血清培养基以1-3×105·mL-1细胞密度接种于6孔培养板，每孔2mL，于37℃，5%CO2培养箱培养24h，待细胞汇合度达60%～80%时，按每孔2μg的质粒DNA与6μL的Fugene6转染试剂即3∶2的比例转染细胞。空转染对照组不含质粒DNA，阳性对照组为重组的野生型质粒，阴性对照为pcDNA

8、3.1+质粒。培养6h后，更换含有血清的全培养基继续培养以进行后续的免疫印迹分析和免疫荧光分析。　　1.5免疫印迹(HEPES，pH7.9;10mMKCl;1.5mMMgCl2;1mMDTT和1mMPMSF)冰浴15min裂解细胞，4℃下12000r·min-1离心20s，弃上清。用含有1倍蛋白酶抑制剂混合物的裂解液B(20mMHEPES，pH7.9;420mMNaCl;1.5mMMgCl2;0.2