BLyS突变体的构建、表达、纯化和功能鉴定.pdf

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1、摘要B淋巴细胞刺激因子(Blymphocytestimulator,BLyS)是TNF家族中的一员，又称为B细胞激活因子(BcellactivatingfactorbelongingtotheTNFfamily,BAFF)。在体内外实验中，可溶性BLyS(sBLyS)能够特异性作用于B细胞，诱导B细胞分化、增殖和存活。如果敲除BLyS，小鼠体内的T1期B细胞相对正常，T2期和成熟B细胞缺失。因此，BLyS在B细胞的成熟过程中发挥至关重要的作用。而在BLyS过量表达时，小鼠表现出自身免疫性疾病样症状，提示BLyS

2、与自身免疫性疾病的发生密切相关。新近的研究发现，部分B细胞型肿瘤细胞能够合成BLyS。分泌的BLyS，可能与自身细胞的BLyS受体结合，形成自分泌途径，参与B细胞肿瘤的生长与存活。因此，BLyS的拮抗剂可能成为治疗自身免疫疾病和某些肿瘤的新型药物。首先，我们根据BLyS与其受体的相互作用结构，设计出五个BLyS的突变体，．以pET22b(+)．／sBLyS为模板扩增BlyS的突变体，然后，将突变体基因酶切下来，连接到原核表达载体pET32a(+)，进行表达、纯化，得到五个BLyS突变体蛋白(M1、M2、M3、M

3、4、M5)。我们设计了两组实验检测BLyS突变体的功能。第一组实验：通过MTT比色法，用BLyS及其突变体刺激小鼠脾细胞来检测他们的功能；第二组实验：将BC／PC质粒(BC／PC质粒为可表达BCMA蛋白的质粒)和NF—KB-luc质粒共转染进入293T细胞，当BCMA在293T细胞表面表达后，用BLyS及其突变体刺激，根据检测的荧光值的不同来判断有意义的突变位点。根据两组实验的结果，我们得到BLyS突变体M2、M4、M5的突变位点有意义，其中突变体M5的突变位点最有意义，这将为我们根据确定的突变位点设计BLyS

4、的拮抗肽提供了依据。关键词：BLyS突变体；脾细胞；MTT；转染293T细胞ABSTI认CTBlymphocytestimulator(BLyS)，alsoknownasBcell·activatingfactorbelongstoTNFfamily(BAFF)，orTNFandapoptosisligand-relatedleukocyte-expressedligand1(TALL·l1isamemberofTumorNecrosisFactor(TNF)family．ItsrolesinBcelldeve

5、lopmentandautoimmunediseaseshavebeenstudiedintensively．／nvitroexperimentsdemonstratedthatBLyScouldbindBcells，stimulatetheirproliferationandpromotetheirsurvival．InBLyS小mice，therearenomatureBcellsinperipherallymphoidsystems．Incontrast，overexpressionofBLySintra

6、nsgenicmiceresultsinincreaseofperipheralBcellssignificantlyandleadstoautoimmunediseases—likesymptoms．NewlystudiessuggestedthatBLySanditsreceptorsmightbeinvolvedinthegrowthandsurvivalofmultiplemyeioma(MM)andlymphmacells．Moreinterestingly,somepatients’MMcellsa

7、swellasMMandBcelllymphomacelllinesexpressBLySandmayformanautocrinelooptostimulatetheirgrowthandpromotetheirsurvival．Inthisstudies，wefirstdesignedfiveBLySmutants，consideredwithstructuralcomplementaryandelectrostaticmatchingwhileBEySanditsreceptorcontactedeach

8、other,amplifiedthemwithpET22b(+)／sBLyS，thencutmutantsgenewithrestrictionenzymes，ligatedthemtopET32a(+)．Afterexpression，purification，wegotfiveBLysmutantproteins．FordetectingfunctionofBLySmutants，