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《微丝相关蛋白hhbrk1突变体的构建_表达及纯化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、军事医学科学院院刊2005年12月第29卷第6期528BullAcadMilMedSci,Dec2005;Vol29No6微丝相关蛋白hHBRK1突变体的构建、表达及纯化1,21131313雷呈祥,隋建丽,白贝,颜贤忠,徐勤枝,周平坤(1.军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京100850;2.海军医学研究所,上海200433;3.军事医学科学院仪器测试分析中心,北京100850)[摘要]目的:构建微丝相关蛋白hHBRK1截短体和突变体原核表达载体,并表达及纯化融合蛋白。方法:采用常规PCR并结合定点突变技术,对hHBrk1基因进行缺失和点突变;利用限制性
2、内切酶将PCR产物克隆至原核表达载体pGEX24T;IPTG诱导融合蛋白表达,通过谷胱甘肽2琼脂糖纯化技术分离纯化GST融合蛋白。结果与结论:构5657建了包括氨基端缺失截短体hHBRK12ΔN、羧基端缺失截短体hHBRK12ΔC和点突变蛋白hHBRK12SG在内的原核表达质粒,分离获得较高纯度的重组hHBRK1突变体融合蛋白,Western杂交证实纯化蛋白为GST融合蛋白。本实验为进一步研究hHBRK1的相互作用蛋白及其可能的结合位点提供了基础。[关键词]hHBRK1;肌动蛋白类;基因突变;融合蛋白;微丝蛋白质类;聚合酶链反应[中图分类号]Q754[文献标
3、识码]A[文章编号]100025501(2005)0620528204Construction,expressionandpurificationofF2actinrelatedproteinhHBRK1mutants1,21131313LEICheng2Xiang,SUIJian2Li,BAIBei,YANXiang2Zhong,XUQin2Zhi,ZHOUPing2Kun(1.BeijingInstituteofRadiationMedicine,Beijing100850,China;2.InstituteofNavyMedicine,Shanghai
4、200433,Chi2na;3.InstrumentalAnalysisCenter,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850,China)[Abstract]Objective:Toconstruct,expressandpurifythemutantandthetruncatedhHBRK1proteins.Methods:Pol2ymerasechainreaction(PCR)andthesite2directedmutagenesistechniquewereusedfordeletionandt
5、hesitemutationofhHBrk1gene.PCRproductswereclonedintopGEX24Tvectorrespectivelywithrestrictiveendonuclease.RecombinationGSTfusionproteinswereinducedwithIPTGandthesemutantandtruncatedhHBRK1proteinswerepurifiedbyglutathionSepharose4Baffinitychromatography.Westernblotwasusedtoidentifyth
6、erecombinationGSTfusionproteins.Results5657andconclusion:RecombinantplasmidsincludinghHBRK12ΔN,hHBRK12ΔCandhHBRK12SGwereconstructed.ThesemutantsandtruncatedhHBRK1proteinswereinducedby0.8mmol/LIPTG,purifiedfromsupernatantofbacteriallysisandfurtheridentifiedwithWesternblot.Thesemutan
7、tsandtruncatedhHBRK1proteinswouldbeusefulinstudyingtheinteractionproteinsandthefunctiondomainsofhHBRK1.[Keywords]hHBRK1;F2actins;genemutation;fusionprotein;microfilamentproteins;polymerasechainreaction在多细胞机体中,细胞功能与结构是相辅相成的,微丝原核表达载体pGEX24T中,在大肠杆菌中获得高效表达。作为细胞骨架的成分之一,参与细胞形态维持、物质运输、细这些
8、蛋白的表达,为下一步寻找hHBRK1相互作用蛋白,明
