人源血管内皮生长因子突变体Ⅱ的克隆表达、分离纯化及初步鉴定-论文.pdf

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1、药物生物技术194PharmaceuticalBiotechnology2013，20(3)：194～197人源血管内皮生长因子突变体Ⅱ的克隆表达、分离纯化及初步鉴定曹荣月，张鹏，徐茂磊，陈檬，邢芸，胡晓利，黄巧玲(中国药科大学生命科学与技术学院微基因药物实验室，江苏南京210009)摘要构建人源血管内皮生长因子突变体hVEGF121II的重组原核表达质粒，获得hVEGF121II蛋白用于制备抗血管生成作用更强的抗肿瘤疫苗。利用PCR技术，在已构建的hVEGF121I突变体的基因末端引入热休克蛋白mHSP70的407—426两段串联重

2、复序列的编码基因，PCR产物经历III和NcoI双酶切后连接到经同样限制性内切酶切过的原核表达载体pET-28a(+)上，转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，乳糖诱导表达，超声破碎菌体，包涵体经洗涤、溶解、稀释复性、离子交换层析得到目的蛋白hVEGF121Ⅱ，Western—blot鉴定。结果成功构建了hVEGF121II蛋白的表达质粒pET-28a(+)-hVEGF121II，重组菌株经乳糖诱导后，目的蛋白表达量占全菌蛋白的62％，分离纯化后纯度达到95％，hVEGF121II蛋白的单体和二聚体都可以和VEGF抗体结合。重组hVE

3、GF121II蛋白的表达成功为进一步对其进行免疫学研究奠定了基础。关键词血管内皮细胞生长因子；突变体；免疫原性；抗血管新生；抗肿瘤；包涵体中图分类号Q5；Q78文献标志码A文章编号1005-8915(2013)03—0194-04肿瘤血管生成与肿瘤的生长、侵袭和转移等特性密切生物工程有限公司；DNAMarker、蛋白Marker、蛋白预染相关，在众多肿瘤诱导的血管生成因子中，VEGF是最主要Marker购于北京全式金生物技术有限公司；Cellulose—DEAE的、特异性最强的一种内皮细胞生长因子。。由于在胚胎52为美国Whatman

4、公司产品；辣根过氧化物酶标记的羊抗发育初期机体即对其产生免疫耐受，因而作为一种肿瘤相兔二抗购于武汉博士德生物工程有限公司；其余药品及试关抗原，VEGF具有抗原性弱的特点。实验室的前期研究剂均为市售分析纯。显示，用破伤风毒素(rITI’)2个强T细胞辅助表位618—6271．2方法位肽段和831．838位肽段替换hVEGF121的1—8位和115-1．2．1突变体hVEGF121IIDNA片段的获得根据121位2个肽段，构建了hVEGF121突变体I，与佐剂联用hVEGF121突变体I序列和载体pET28a的多克隆位点，设免疫小鼠，表现

5、出对小鼠$180移植瘤的抑制作用，抑瘤率计1条上游引物和4条下游引物，通过4次PCR加端，将编达50％，同时疫苗具有较好的安全性。码热休克蛋白mHSP70的407—426两段串联重复序列的基为进一步提高疫苗的免疫原性，在已构建的hVEGF121因连接于hVEGF121突变体I基因序列的3末端，突变体I基础上设计hVEGF121突变体Ⅱ。通过加端PCR，hVEGF121突变体I序列与M序列及两段M之间添加柔性将热休克蛋白mHSP70分子中具有免疫激活调节作用的肽ss序列，并在上游引物中引入NcoI酶切位点，下游引物407—426片段(M

6、序列)串联2次，以柔性肽连接于P4引入终止密码子和肺III酶切位点。引物序列如下hVEGF121突变体I的C末端，以激发针对VEGF更强的免(均为5．3，』顷序，下划线处为酶切位点)：疫反应，进一步抑制肿瘤血管生成，获得更好的抗肿瘤效果。上游引物P0：CATG△ACATCATCGAcGAcT1材料与方法下游引物P1：1．1材料ATCAAAGCTAACTCTAAATIITCTAGCCAGCCTFCCGT1．1．1质粒和菌种大肠杆菌EcoliBL21(DE3)，质粒GCAGATCCAGGTCTACCApET28a及pET28a-hVEGF

7、121I均为本实验室保存。下游引物P2：1．1．2试剂引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；限GTGCAGATCCAGGTCTACCAGGGCGAGCGCGAGATrG制性内切酶／／／ndIII、NcoI、TaqDNA聚合酶、T4连接酶均CCGCTCACAACAAGTCTA购于Fementas公司；质粒抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂下游引物P3：ATrGCCGCTCACAACAAGTCTAGCCAGCCrI'TCCGTGC盒、DNA胶回收试剂盒、兔抗人VEGF抗体均购于上海生工差耋昙曼：闻20寡13白-0钬1-2科8学甚余：73／H30

8、04)霉；大学生创新药物研制能力偎提高项目(儿J103083o)。o~,TTeell：：00225-83271242,E-mail：caoron作者简介：曹荣月，副教授，硕士生导师，中国药科大学生命科学与技术,⋯“⋯‘曹