泛素行异性蛋白酶usp26突变型去泛素化酶活性检测

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1、河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应的法律责任。研究生签名：交Il钢导师签章：级学伽f研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，

2、指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：纠钰导师签章：I司黻仉J>年弓月7日目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4研究论文泛素特异性蛋白酶USP26突变型去泛素化酶活性检测前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．8月U吾⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．8材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．8结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．16附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．19讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．24结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．25参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．25综述泛素特异性蛋白酶USP26的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．29致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．37个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．38中文摘要泛素特异性蛋白酶USP26突变型去泛素化酶活性检测摘要目的：泛素特异性蛋白酶(ubiquitinspecificprot

4、ease，usp)26基因位于X染色体q26．2区域，基因编码区由一个外显子构成，含2794个碱基，编码913个氨基酸，推测其蛋白质分子量约104KDa。班p2继因属于去泛素化酶家族(deubiquitinatingenzymes，DUBs)，去泛素化酶在泛素蛋白酶体途径发挥多个作用，包括多聚泛素链的分离，将被泛素化的蛋白上的泛素去除以避免蛋白被降解，以及去除泛素残基促进蛋白酶体的降解作用和泛素的再利用，进而调节蛋白的活性或其降解。Usp26自flwang等首次报道，分离自小鼠精原细胞。在人和小鼠中，usp26在睾丸组织特异性表达。但是目前对于卿2继

5、因的生理机制和分子途径并不十分清楚。最近有一些研究指出，usp26基因多态性可能与男性不育相关。DiracAM等的研究提示USP26在雄激素受体信号传导途径中的作用可能与其去泛素化酶活性有关。因此，我们通过检钡)Jusp26)L种突变型的去泛素酶活性变化，研究usp26基因的几种突变型对其去泛素化活性的影响，为usp26的分子途径和生理功能提供线索，同时为研究usp26基因与男性不育症的关联性研究奠定基础。方法：1质粒的构建。野生型usp26基因由荷兰研究者AnnetteM．G．Dirac提供。利用野生型usp26基因为模版，进行PCR扩增，引入Ba

6、mHI酶切位点，以便后续构建质粒。引物序列：上游引物为5’．QQ缱￡￡ATGGCTGCCCTATTCCTAC．3’，下游引物为5’一鱼鱼△!ggTTATTCCTTCTGAAGGGTCTCC．3’。PCR产物纯化回收后进行BamHI位点酶切反应，连接到pGEX．6p．1中。构建的质粒pGEX．usp26最后进行测序鉴定。将pET-3d质粒的T7启动子以BglII和H／ndIII酶切位点切下，与BamHI及HindIII处理的pACYCl84质粒进行连接，确保T7启动子处于阅读编码框内。将已构建的pGEX．usp26中的usp26基因以BamHI酶切位点

7、切下，连入pAC．T7中。将构建的pAC．T7．usp26质粒进行测序鉴定。中文摘要2定点突变。利用定点突变的方法构建5个SNP：468G>T、1274C>T、2144A>T、2204T>G、2239A>T突变型及CS无活性突变型911G>C。分别以特异性引物进行定点突变PCR反应，反应条件95℃预变性30sec，95℃变性30sec，55℃复性1min，68℃延伸10min，18次循环，最后72℃延伸5rain。3去泛素化酶活性分析。采用模型底物GST-Ub52及Ub-Met．p—gal进行去泛素化酶活性分析。质粒pACYC．usp46和pAC．T

8、7分别作为阳性对照和阴性对照。将pAC．T7．usp26野生型、pAC．T7一usp26突变型、pACYC—