云泛素化酶usp26基因的2个无义突变及6个借义突变对其酶活性的影响

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1、河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名为单位河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应法律责任。研究生签名：撇导师签章：嗽级学院领导盖章：困日墨霜矗■■_，-洳lUc年弓月弓1日河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中

2、不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：躯超暑导师签章：闩≯h年弓月弓f日目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4研究论文去泛素化酶USP26基因的2个无义突变及6个错义突变对其酶活性的影响前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7日U舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．／材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯．．8结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15#口木⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．19附表⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31结{仑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32综述常见基因多态性与精子

4、生成异常⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．46个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．47中文摘要去泛素化酶USP26基因的2个无义突变及6个错义突变对其酶活性的影响摘要目的：泛素特异性蛋白酶基因Usp26位于Xq26．2，其mRNA含2794个碱基对，可编码913个氨基酸，USP26蛋白预期分子量为104KDa。研究发现X染色体上存在许多可导致雄性不育的异常基因，其中就包括特异性表达于睾丸组织中的Usp26基因。2005年Stouffs等首次报道了Us

5、p26基因突变与精子生成障碍的相关性，随后一些研究也先后提出Usp26基因突变会引起男性不育。但另外一些研究认为Usp26基因突变可能与精子生成障碍无关。然而，上述研究大部分为观察性研究，且USP26蛋白的功能也不十分清楚。本研究的目的是从分子水平研究分析野生型和突变型USP26蛋白的酶活性功能，以便了解Usp26基因突变的生物学意义。目前，有文献报道的Usp26基因突变有23个，其中有15个突变位点本课题组已成功构建并检测了其对泛素特异性蛋白酶USP26活性的影响发现这些位点突变并未影响USP26的去泛素化酶活性，认为Usp26基因中这15个突变位点可能与男性不育症

6、并不相关。为了确证剩余8个突变位点(520G>T、565G>T、1037T>A、1498G>A、1549C>T、1609C>G、2182A>T和2195T>C)是否影响USP26的活性，本研究构建了这8个突变位点的表达质粒，采用己建立的去泛素化酶活性检测体系检测了各突变位点对USP26酶活性的影响，为进一步了解Usp26基因突变在男性不育中的作用奠定分子基础。方法：1构建pGEX．Usp26各种突变质粒。以本室保存的pGEX．Usp26wT为模板，采用定点突变的方法构建2个无义突变(520G>T、565G>T)及6个错义突变(1037T>A、1498G>A、1549C

7、>T、1609C>G、2182A>T和2195T>C)的重组质粒，并用限制性内切酶酶切法和DNA测序法鉴定突变型重组质粒。2构建pAC．T7．Usp26各突变质粒。采用限制性内切酶BamHI从已构建的pGEX．Usp26各突变质粒中切出Usp26基因目的片段，将其克隆中文摘要到pAC—T7载体质粒，以构建pAC—T7一Usp26各突变质粒，并用SalI和PstI酶切鉴定。3采用Ub—Met．B．gal和GST-Ub52两种不同的模型底物对各突变型USP进行去泛素化酶活性分析，底物蛋白检测采用WesternBlot法，利用Odyssey双色红外激光成像