foxo3a转录因子对慢性粒细胞白血病k562细胞增殖、凋亡与诱导分化作用的研究

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1、厦门大学硕士学位论文FoxO3a转录因子对慢性粒细胞白血病K562细胞增殖、凋亡与诱导分化作用的研究姓名：李楠楠申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：王玮201205中文摘要摘要慢性粒细胞白血病一旦发展至急变期，预后极差，目前的各种治疗方法均不能有效控制其病情进展，多在数月内死亡，因而加强对急变期的研究具有很重要的科学及临床意义。急变发生机制中，BCR-ABL融合基因大量表达、继发性多种基因突变以及凋亡受阻、耐药等机制逐渐已经被阐明，但有关分化障碍的机制研究很少且不明确【l；2】。分化障碍往往与信号通路中的转录因子异常有关，Fox03a

2、是FOX转录因子家族是一个重要成员，是BCR-ABL／P13幻AKT信号通路的下游因子，而其在慢粒急变中的功能失活，可能在慢性粒细胞白血病的发生发展中发挥重要作用，值得进一步研究。目的：研究Fox03a去磷酸化激活或过表达后，对慢粒急变细胞K562细胞株的增殖、凋亡及诱导分化作用，明确Fox03a是否具有诱导慢粒急变细胞分化作用，并研究Fox03a与造血分化调控因子砌l、BTGl基因的关系，初步探讨Fox03a对慢粒分化障碍的机制，有利于从分化障碍角度进一步明确慢粒急变的机理，并为慢粒急变提供一个新的诱导分化治疗方法和靶点。方法：采用基因

3、重组技术从人单核细胞中提取I矾A反转录成cDNA，以其为模板，使用含有酶切位点的引物进行PCR扩增，回收PCR产物，对pIERS2．EGFP和PCR回收产物进行酶切、纯化、连接，并转化和筛选抗性细菌克隆，提取质粒，进行酶切、测序鉴定，获得p正RS2-EGFP．Fox03a质粒。通过非脂质体FuGeIlEHD转染试剂将pIERS2．EGFP．Fox03a质粒转染K562细胞。以PCR、Wbstem-blot检测Fox03a基因的表达效果。增强FoX03a在K562细胞中的表达后，通过Cell胁BlueCellviabil时触say检测K56

4、2细胞的活性变化；流式细胞术检测细胞周期时相分布、细胞凋亡；Westem．b10t检测p27bpI、Bim基因的表达变化；采用联苯胺染色检测K562细胞联苯胺阳性率、流式细胞术细胞检测表面抗原GPA、CDl1b的表达变化；通过PCR、Westem-blot检测分化相关基因嘲1、BTGl的表达情况。结果：成功构建重组质粒p砸RS2．EGFP．Fox03a，经过酶切和测序鉴定与预期目的一致。非脂质体FuGeIlEHD转染试剂介导K562细胞转染质粒VIII中文摘要pIERS2．EGFP．Fox03a，应用PCR、W色sten卜blot鉴定证实

5、目的蛋白Fox03a在K562表达。转染重组质粒pIERS2．EGFP．Fox03a组与其它对照组相比，Cell．titerblue结果显示细胞增殖能力减弱(p<0．05)；流式细胞术显示细胞阻滞在G0／Gl期，并伴随着p27¨p1表达升，细胞调亡比例增加且伴随着Bim的表达升高，提示Fox03a可上调Bim基因的表达促进细胞的凋亡。增加K562细胞中Fox03a基因的表达后，联苯胺染色阳性率升高，细胞形态学趋向于成熟方向分化改变，细胞表面GPA抗原表达升高，髓系细胞表面分化抗原CDllb较对照组及空白对照组升高，但不如GPA抗原变化明显

6、，，同时伴随着瑚l、BTGl基因的表达降低。FOX03a可诱导K562细胞向成熟细胞分化，其机制可能与下调附l、BTGl的表达有关。结论：成功构建重组质粒pmRS2．EGFP．Fox03a；过表达Fox03a可抑制细胞增殖；可上调p27kjpl、Bim基因的表达，阻滞细胞周期进程和促进细胞凋亡。Fox03a可诱导K562细胞向红系分化，其机制可能与下调造血分化因子嘲1、BTGl的表达有关。关键词：FOX03a；分化；造血分化因子；K562细胞；凋亡Ⅸ英文摘要ABSTRACTCMLh雒apoorpr0口osisoncedeveloptobl

7、aSticphasewim1arj薛ofundi丘硪ntioncells．andnlereisnoe饪bctivetre咖emtocontrolitspro伊鼯sion．ExpressionofBCR-ABLresultSillgrowcll蠡lctofi11d印endenceofcells锄dactiVa：cesmultiplesill印aliIlgcaScades，iIlcluding廿lephospllatidylinositol3-kiIlase(P13K)／I)roteinhnaseB(PKB／c—AKDsi酬ingpatbwa

8、y．nl幽beendemons舡atIedtllatthemembersoftheFOXOsubfamilyof位mScription缸t0硌Fox03aisdhctlyphosphoryla