紫草素诱导白血病细胞k562凋亡的研究

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1、紫草素诱导白血病细胞K562凋亡的研究作者：陈志炉蒋慧芳史亦谦周郁鸿【摘要】目的探讨紫草素对人白血病K562细胞的诱导凋亡作用。方法MTT显色法检测紫草素对K562细胞的增殖抑制作用；形态学观察分析DNA琼脂糖凝胶电泳；AnnexinV/PI双标记法检测紫草素对K562细胞的凋亡效应；Caspase检测K562细胞凋亡通路。结果紫草素0.25～8μg/ml浓度即能明显抑制K562细胞的增殖，并具有时间和浓度的依赖性。1μg/ml紫草素作用48h后的K562细胞出现凋亡细胞的特征。1～4μg/ml浓度紫草素诱导K562细胞凋亡具有明显的量效关系

2、，2μg/ml紫草素在0～72h内诱导K562细胞凋亡具有明显的时效关系；DNA凝胶电泳呈现细胞凋亡的典型梯形条带；紫草素诱导K562细胞凋亡经历了Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9的激活。结论紫草素能有效地诱导K562细胞凋亡，并主要通过线粒体凋亡通路。【关键词】紫草素K562细胞细胞凋亡　　【Abstrat】ObjectiveToevaluatetheapoptoticinductionofshikoninonhumanleukemiaK562cells.MethodsMTTcolorimetricassayine

3、thegroorphologicalobservation,DNAagarosegelelectrophoresisandAnnexinV/PIdoublelabeling.Theapoptosispathe-dependentmannerattherangeof0.25to8ug/ml.TheK562cellstreatedlshikoninfor48hoursshoorphologicalcharacteristicsofapoptoticcells;TheK562cellstreatedl)for48hours;lshikoninfor

4、24,48and72hours;inductionofapoptosiseandconcentration.ThereanleukemiaK562cells,andthekeyismitochondrialapoptosispatha）、AnnexinV/PI试剂盒（BenderMedsystems）、DNA提取试剂盒（上海申能博彩生物公司），Caspases试剂盒（RD）、紫草素（中国药品生物制品检定所)。　　1.2细胞培养　　K562细胞用含体积分数为10%热灭活小牛血清（56℃，灭活30min）的RPMI1640培养基，置37℃体积分数

5、为5%的CO2培养箱中常规培养，每2～4d传代一次，取对数生长期细胞进行实验。　　1.3紫草素对细胞生长抑制作用的观察　　取对数生长期的K562细胞按5×104/ml的密度接种于96孔板，每组设6个平行孔，分别加入紫草素，使实验组的终浓度分别为0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml，对照组加入等体积的RPMI1640培养液，置37℃、5%CO2的培养箱中培养。分别于作用24、48、72h时取出96孔板，加入5mg/ml的MTT20μl在相同条件下继续培养4h后离心5min，吸取上清液，每孔

6、加入DSMO150μl，振荡20min，用酶标仪于570nm处测定各孔的吸光度值（A570）。抑制率（%）=（A对照-A实验）/A对照×100%。　　1.4细胞形态学观察　　收集药物处理48h后的细胞，经磷酸盐缓冲液洗2遍后，离心、制片，Nacl和RNaseA3μl，水浴后加入300μl无水冷乙醇，离心收集DNA，在2%的琼脂糖凝胶上电泳1～1.5h，紫外灯下摄片。　　1.6AnnexinV/PI双标记法　　离心收集药物处理24、48、72h后K562细胞1×106，PBS洗2次，用1：4bindingbuffer缓冲液190μl重悬细胞，加

7、入FITC（异硫氰酸荧光素）标记的AnnexinV-FITC5μl和20μg/mlPI10μl，置冰上作用10min，用流式细胞仪检测。实验结果经Cellquest3.1.f软件分析。　　1.7Caspase活力检测　　1μg/ml紫草素作用于K562细胞48h后收集2×106细胞，用PBS洗2遍，加入50μlcoldCellLysisBuffer，放置在冰上作用10min，离心收集上清液，种于96孔平底板，每孔加入50μl2×ReactionBuffer和5μlCaspase-3、6、9(VEiD-pNA)，置37℃、5%CO2的培养箱中培

8、养1h,用自动酶标仪测定405nm区的吸光度值（A405）。　　1.8统计学处理　　采用SPSS10.0统计软件，数据资料以(x±s)表示，两组间比较用t检验，多处