cycline干扰rna对肝癌hepg2细胞株蛋白质组的影响

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1、凼鐾直匡堂瞳亟±堑塞生堂鱼迨塞!型墨生26leoftwogmupsdisplayedobviouslydi虢rence，and谢ousdis6nctdi虢陀ntp110tei璐rI唧jointogetllerinHCCmetast船is锄dtumorgro州h．KeywordsHepG2ceURNAinte彘rencecycliIlEpmteome2一DErn鹅s8pec。trometryCyclinE干扰RNA对肝癌HepG2细胞株蛋白质组的影响肝癌多发于非洲和东南亚地区，也是我国东南沿海地区及东南亚国家高发的恶性肿瘤之一，全世界每年

2、约50万一100万人死于该病，其中原发性肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，其死亡率在消化系统恶性肿瘤中列第二位，仅次于胃癌Ⅲ。肝癌(hepatocellularc踟inoma，Hcc)是最常见的恶性肿瘤之一，死亡率高，严重危害人们的身体健康。早期诊断和及时治疗是提高肝癌患者成活率的关键，但目前的诊断方法敏感度低、特异性差，已成为肝癌诊疗的一个难题，所以寻找特异的肝癌标志物已经成为肝病研究领域的热点o90年代，随着对细胞周期调控认识的不断深入，一系列细胞周期调节因子被证明与包括肝癌在内的一些实体肿瘤的发生发展有密切关系‘2-4】．eyclinE

3、是一种细胞周期素，在Gl—S期它与细胞周期依赖性蛋白激酶cDI(2结合，促进细胞通过G1／S限制点而进入S期"J。目前有研究表明CyclinE过表达将缩短G1期进程，导致细胞增殖失控，促进细胞恶性转化和肿瘤发展MJ。近年来迅速发展的蛋白质组学研究，能动态、整体、定量地考察疾病发生发展过程中全部蛋白质种类、数量的变化，对于探讨疾病机理、寻找疾病诊断的特异性标志物和药物治疗的靶标来说，是一种有效的高通量的研究模式，可获得一些传统手段无法得到的新蛋白标志物、新关键分子，极大地丰富诊断标志物选择组合及复杂致病机理的全面阐明"]。运用该策略，本研

4、究对cyclinE干扰RNA干扰前后的肝癌HepG2细胞全细胞蛋白，进行双向凝胶电泳，并用质谱技术对差异表达的蛋白质进行分析鉴定，为进一步探讨肝癌发病机理以及肝癌的早期诊断、治疗提供参考依据。1．材料与方法1．1．材料：1．1．1．细胞株、质粒肝癌HepG2细胞株：由解放军304医院提供cyclinE干扰RNA质粒pU6一cyclinE—shRNA：由内蒙古医学院生化教研室关泽红老师惠赠1．1．2．引物合成PCR引物：自行设计，宝生物工程有限公司合成。囱鏊直匿堂瞳亟±婴窒生堂垡迨塞(兰QQ壁生2cyclinE特异性弓I物：P1：5’一A

5、CCAGT7I’rGCGTATGTGAC一37P2：57一CTGC7rC7rGCl]陀’兀1ACCG一3，．产物长度为583bp。1．1．3．试剂RPMI1640培养基Gibco小牛血清Hyclone胰蛋白酶Gibco琼脂糖华美生物工程公司溴化乙锭美国si肿a溴酚兰上海生物工程有限公司DEPC洛阳华美生物工程公司甲醛北京化学试剂厂氯仿北京化工厂无水乙醇北京化工厂Lipofect锄ine删2000转染试剂盒hvinDgenRT—PCR试剂盒大连宝生物工程公司G418美国生命技术公司TaqDNAPolyIneme大连宝生物工程有限公司dNr

6、I甲大连宝生物工程有限公司DNAMarker大连宝生物工程有限公司蛋白质分子量标准：6．5KD一2．0000KD舢I玳sco公司2一D—CleaIl—upKit试剂盒GEHealtlIcareBio—Sciences公司TEMEDsigma公司IPGBufrerGEHealthc棚．eBio—Sciences公司IPG胶条pH3一10，13cmGEHealtllcareBio—Sciences公司其它常规试剂均购自GEHealtllcareBio—Science8公司和8i鲫a公司1．1．4．主要溶液的配制(1)细胞培养基：RPMI一1

7、640培养基一袋，加去离子水900IIll，N枷c03调pH至7．2—7．6，定容到l000Illl，过滤除菌。4℃保存。(2)细胞消化液：O．19ED’rA，1．259胰酶，加去离子水450Inl，调pH至8．O，加去离子水至500ml，过滤除菌，一20℃保存。(3)双抗：100ug／rIll氨苄青霉素19，100ug／H11硫酸链霉素19加去离子水至100IIll，过滤除菌，1．OrIll分装于1．5IIllEp管，一20℃保存。(4)PBS溶液：8．oogNaCL，O．29kcl，1．569Na2HP04，0．29KH2P04加去

8、离子水至1000IIll，高压灭菌，4℃保存。(5)O．4％台盼蓝溶液(W／V)：O．49台盼蓝溶于100IIllPBS，室温保存。囱鐾直匿堂瞳亟±受窒生堂鱼迨塞f塑璺生2(6)100mmoL／L苯甲基磺酰