人肝素酶rna干扰对hepg2肝癌细胞生物学行为的影响

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1、第三军医大学硕士学位论文人肝素酶RNA干扰对HepG2肝癌细胞生物学行为的影响姓名：熊震申请学位级别：硕士专业：内科学（消化系病）指导教师：杨仕明20071101第三军医大学硕士学位论文人肝素酶RNA干扰对HepG2肝癌细胞生物学行为影响木摘要研究背景及目的恶性肿瘤是当前严重影响人类健康的最重要的疾病之一。而肿瘤的侵袭和转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤的早期诊断和早期治疗固然是肿瘤患者获得长期生存的主要途径，但许多就诊的患者多已发生转移，而常规的手术和放、化疗疗效有限。如何有效延长这类患者的生存期显

2、得尤为重要。肝素酶(Heparanase，Hpa)是目前发现的唯一能降解细胞外基质(Extracellularmatrix，ECM)及基底膜(Basememebrance，BM)中乙酰肝素蛋白多糖(heparansulfateproteoglycaJls，HsPG)的内源性糖苷内切酶。在正常组织中除淋巴细胞、骨髓等呈低表达外，在正常成熟的非免疫组织中(如心、肺、肝脏、骨骼肌及胰腺等)均不表达，但是在几乎所有的转移性恶性肿瘤细胞中普遍存在。目前的研究表明，肝素酶在诱导肿瘤血管生成、促进肿瘤侵袭和转移方面具有

3、重要作用，而抑制肝素酶的表达可明显抑制肿瘤的增殖及转移。因此肝素酶作为一种肿瘤基因治疗的靶点已经受到越来越多的关注。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指小分子双链RNA(siRNA)转录后基因沉默。siRNA主要通过特异地与序列互补的mRNA结合，并促使其降解。RNAi技术近年来发展非常迅速，尤其是在2001年《Science》杂志首次报道siRNA可以诱导哺乳动物细胞特异性基因沉默后，RNAi逐渐成为生物医学研究中的一项重要的实验工具。目前RNAi技术已基本替代传统的反义核酸技术诱

4、导特异性基因沉默而广泛应用到基因功能鉴定、基因表达转录后调控等热门领域，并为多种疾病的基因治疗提供了新的思路。基于以上分析，本实验拟通过RNAi技术诱导Hpa在HepG2肝癌细胞中沉默，并研究沉默Hpa后的HepG2细胞在肿瘤的生长、侵袭等各方面的变化情况，为Hpa作为肿瘤基因治疗的靶点提供理论依据。研究方法1．通过GenebaJlk找到人肝素酶mRNA序列，应用网络在线工具设计3条干扰序+本课题受国家自然科学基金资助(No_30570841)第三军医大学硕士学位论文列，经BLAST设计一组无关序列为阴性

5、对照序列；设计包含干扰序列及无关序列的dsDNA并进行生物合成；双酶切pGenesil．1质粒；将合成的dsDNA克隆至酶切质粒；测序鉴定后进行质粒抽提及纯化。2．培养HepG2细胞，采用脂质体法将各重组干扰质粒稳定转染至HepG2细胞；G418抗性筛选3周；从各组细胞中挑取单克隆扩大培养。3．采用RealTimeRT．PcR和westemblot分别检测干扰及未干扰的HepG2细胞肝素酶的表达，筛选有效的干扰序列。4．采用不同的实验技术检测肝素酶RNA干扰后HepG2细胞增殖能力、细胞周期、克隆形成能力

6、、侵袭能力及体内成瘤能力的变化。实验结果1．通过www．genscript．com网站的0nlinet001s找到三条肝素酶干扰序列，分别为：No．1(1214—1232)：5’一GGETATCTCTTCTGTTCAA一3’，No．2(167．185)：57．TCCTGTCCGTCACCATTGA．3’，No．3(611—629)：5’一CTCAGTTGCTCCTGGACTA．3’，及阴性对照序列5’一ACTACCGTTGTATAGGTGT一37；并成功将包含各干扰序列及阴性对照序列的dsDNA克隆至质粒

7、pGenesil．1，经测序鉴定后，证实所连入的序列与设计序列一致，分别命名为pGenesil一1／Hpa／siRNA一1、pGenesil—1／Hpa／siRNA一2、pGenesil—l／Hpa／siRNA一3、pGenesil—1／Hp“siRNA—N。2．采用脂质体法将上述各组干扰质粒成功转染至HepG2肝癌细胞当中，经G418抗性筛选后，得到阳性克隆；扩大培养后各细胞株分别命名为HepG2／RNAi／1．1、HepG2／RNAi／2—2、HepG2／RNAi／3一l、HepG2／RNAi／3—3

8、、HepG2／RNAi／N。3．RealTimeRT．PCR结果表明，干扰组HepG2瓜NAi／1．1、HepG2依NAi／2．2及HepG2瓜NAi／3—3中Hpa在mRNA表达水平明显下调，而HepG2瓜NAi／3一l中的Hpa表达与阴性对照组和HepG2组无差别；westernblot检测结果表明HepG2瓜NAi／1．1与HepG2瓜NAi／3—3两组中Hpa蛋白表达水平较HepG2组和HepG2瓜NAi／N组显著下调