polι在食管鳞癌中过表达机制及其对放化疗敏感性影响研究

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1、Polι在食管鳞癌中过表达机制及其对放化疗敏感性影响的研究中文摘要Polι在食管鳞癌中过表达机制及其对放化疗敏感性影响的研究中文摘要第一部分：跨损伤DNA合成通路基因在食管鳞癌组织中的表达目的研究跨损伤DNA合成(translesionDNAsynthesis,TLS)通路基因在食管鳞癌组织与正常组织中的差异表达情况。方法在mRNA水平采用高通量real-timePCR筛选食管鳞癌/正常组织中显著差异表达的TLS通路基因；在蛋白水平采用免疫组织化学方法检测食管鳞癌组织DNA聚合酶ι(DNApolymeraseiota,Polι)的表达。结果real

2、-timePCR结果表明，与正常组织相比，TLS通路基因中REV3L、REV7L、RAD18、DNA聚合酶κ(DNApolymerasekappa,Polκ)和Polι等基因mRNA表达水平在食管鳞癌组织中显著上调，其中PolιmRNA表达量上调7.2倍；相对应地，免疫组织化学结果表明Polι蛋白在食管鳞癌组织中亦存在高水平的表达。结论TLS通路中的关键基因REV3L、REV7L、RAD18、Polκ和Polι在食管鳞癌组织中的表达明显高于正常组织，食管鳞癌组织中TLS通路基因特别是Polι基因的mRNA表达上调是食管鳞癌癌变的标志之一。第二部分：

3、Polι在食管鳞癌组织中过表达的机制目的从DNA甲基化、组蛋白乙酰化和转录因子结合多个角度探讨食管鳞癌组织与正常组织中Polι基因mRNA表达差异的机制。方法(1)采用亚硫酸盐测序法检测食管鳞癌组织和正常组织中Polι基因启动子区CpG位点的甲基化情况；(2)采用DNA甲基化转移酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理食管癌细胞株Eca-109和TE-1，观察DNA甲基化和组蛋白乙酰化对食管癌细胞中Polι基因mRNA表达的影响；(3)构建Polι调控荧光素酶报告基因的重组体，转染食管癌细胞Eca-109和TE-1，以荧光素酶活性大小反映不同长度启动子

4、I中文摘要Polι在食管鳞癌中过表达机制及其对放化疗敏感性影响的研究对于Polι基因转录效率的影响；将上述重组体与Sp1及Oct-1转录因子表达质粒共转染，检测转录因子是否具有激活作用；采用real-timePCR方法检测食管鳞癌组织与正常组织Polι基因与Sp1、Oct-1基因的mRNA表达是否具有相关性；染色质免疫共沉淀(chromatinImmunoprecipitation,ChIP)分析Eca-109、TE-1细胞和食管鳞癌组织中转录因子Sp1、Oct-1和RNA聚合酶II与Polι基因启动子区特异位点的结合水平。结果(1)与正常组织相比

5、，食管鳞癌组织Polι基因启动子区14个CpG位点的甲基化水平基本无差异；(2)DNA甲基转移酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理未改变Eca-109和TE-1细胞中Polι基因mRNA的表达水平；(3)重组体转染试验表明，与转染pGL3-541、pGL3-367质粒的Eca-109细胞和转染pGL3-794、pGL3-541、pGL3-367质粒的TE-1细胞相比，转染pGL3-1631质粒的细胞荧光素酶相对活性显著升高；转录因子共转染试验表明100ngpcDNA3.1-Sp1、200ngpcDNA3.1-Sp1及200ngpcDNA3.1-Oc

6、t-1能进一步促进转染pGL3-1631质粒在TE-1细胞中的荧光素酶基因的表达；食管鳞癌组织中Polι基因的表达水平与Sp1基因的表达水平显著相关，而与Oct-1基因的表达水平不相关；转录因子Sp1、Oct-1和RNA聚合酶II对Polι基因启动子不同区域的结合能力存在差异，Sp1在C区域结合力最大。结论(1)食管鳞癌组织与正常组织中Polι基因表达差异与启动子区DNA甲基化水平及组蛋白乙酰化程度无关；(2)Polι基因启动子区-1631到-794区域可能含有反式作用因子，对基因的转录调控起到关键作用；转录因子Sp1对Polι基因的转录具有激活作

7、用，Sp1异常结合在启动子-1291至-1081区域可能是导致食管鳞癌组织中Polι基因过表达的原因。第三部分：Polι对食管鳞癌细胞放化疗敏感性的影响目的探讨Polι对食管鳞癌细胞放化疗敏感性的影响。方法构建Polι基因过表达载体pcDNA-Polι与Polι基因干扰载体shRNA-Polι并转染至食管鳞癌细胞Eca-109，CCK-8法和细胞克隆形成法观察Polι对Eca-109增殖的影响；10μM顺铂处理质粒转染后的Eca-10924小时，通过CCK-8法检测Polι对Eca-109铂类药物耐受性的影响；采用不同剂量的6MVX射线照射质粒转染

8、后的Eca-109株，通过细胞集落形成实验检测Polι对Eca-109放射敏感性的影响。IIPolι在食管鳞癌中过表达机制