tead4基因干扰载体构建与敲减肌肉卫星细胞的诱导分化

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1、内蒙古大学硕士学位论文一、试验研究Tead4基因干扰载体构建与敲减肌肉卫星细胞的诱导分化‘_■●o_●一刖青TEAD家族是在进化过程中高度保守的基因，并在哺乳动物胚胎发育中起到重要作用[3】。TEAD家族转录因子能够广泛表达，但是只在某一阶段作为转录激活因子调控特定组织中的基因转录【4】。TEAD家族中有四个成员tead1、tead2、tead3、tead4。Teadl和tead3主要心脏发育相关基因的转录，敲除后会导致小鼠在胚胎发育11d左右由于心室壁过薄而死亡[5-6]，tead2在胚胎发育早期行使功能[7-8】，而tead4参与骨骼肌的

2、分化【2，91，已有的研究显示tead4在小鼠早期胚胎发育过程中也有着不可替代的作用[10。1¨。在小鼠胚胎发育过程中，tead4基因在骨骼肌中表达，免疫共沉淀分析显示tead4是转录因子MYOD1和MOYG的靶基因[91，尽管TEAD4在小鼠肌肉卫星细胞分化过程中被转录因子MYOD1和MYOG上调，并被认为激活了肌肉结构相关基因的转录，但敲除tead4基因并没有证实这一点。2012年Davidson的研究证实了在小鼠成肌细胞中敲减tead4会导致肌肉分化异常，形成的肌管较诱导正常形成的肌管短。并且MYOG和CDKN1A等肌管分化相关基因的表

3、达出现明显变化[21。近年关于TEAD4功能的研究表明，转录因子tead4不仅影响肌肉分化，而且还是小鼠胚胎发育过程中滋胚层分化的重要调控因子。研究证实，tead4在囊胚期TE和ICM中均表达，敲除tead4会导致胚胎发育停滞在桑葚胚期，囊胚腔的形成受到明显抑制，滋胚层的分化缺失，胚胎无法着床。进一步分析显示，TE特异基因cdx2的表达受到抑制、emoes的表达量明显下调【10。131。但是Buonanno等人的研究显示，敲除tead4对胚胎着床后的发育没有明显影响【l41。由此可见，tead4基因在肌肉卫星细胞分化过程中和小鼠胚胎发育过程中

4、都是必不可缺的。Tead4基因在小鼠中对于胚胎发育和肌肉的分化有着重要的作用，但在大动物中的研究几乎没有。本研究采用shRNA干扰技术，敲减牛肌肉卫星细胞中的tead4基因的表达，观察敲减tead4表达后对牛肌肉卫星细胞的分化能力的影响。5汪金泽Tead4基因干扰载体构建与敲减肌肉卫星细胞的诱导分化结果显示，tead4基因表达量的下降对肌肉卫星细胞向骨细胞、神经细胞和肌管细胞的分化没有影响，但其敲减后会导致肌肉卫星细胞向脂肪细胞方向分化出现异常。1．材料与方法1．1设备与材料1．1．1主要仪器设备：恒温水浴锅(Grant)、涡旋振荡器(Lab

5、net)、离心机(Eppendorf)、恒温摇床、微波炉、水平电泳仪、电泳槽、掌式离心机、凝胶成像仪(Tanon．5200)、超速离心机(BeckMan)、移液枪(Eppendorf)、超低温冰箱(Thermo)、微量紫外分光光度计(Thermo)、体式显微镜(Nikon)、生物安全柜(HealForce)、C02培养箱(Thermo)、荧光定量_PCR仪(ABI)、PCR仪(Eppendorf)、荧光倒置显微镜(ZEISS)、液氮罐、高压蒸汽灭菌锅等。1．1。2材料及试剂荷斯坦胎牛肌肉卫星细胞，293FT包装细胞系，基因工程菌株pMD2．G

6、、pMDLg／pRRE、pRSV．REV和pLentiLox3．7(pLL3。7)为本试验室保存；牛胎儿取自内蒙古圣牧高科牧业有限公司；干扰片段与引物的合成由Takara公司完成；相关测序由Invitrogen公司完成。细胞培养，病毒感染以及细胞诱导相关试剂：高糖DMEM(Gibco)、胎牛血清(Hyclone)、马血清(Gibco)、bFGF(Gibco)、Polybrene(Sigma)、胰蛋白酶(Sigma)、DPBS(Gibco)、DMSO(Sigma)、lOOx谷氨酰胺(Gibco)、质粒中提试剂盒(Thermo)、RNAisoPl

7、us(TaKaRa)、无水乙醇(永大试剂)、三氯甲烷(永大试剂)、异丙醇(永大试剂)、LipofectamineTMLTX＆PlusReagent转染试剂盒(Invitrogen)、100×丙酮酸钠(Gibco)。Real．TimePCR用试剂：微量RNA提取试剂盒(AppliedBiosystems)、反转录试剂盒(1nvitrogen)、SYBRPrimeScriptRT—PCR试剂盒(TaKaRa)等。细胞诱导相关试剂：低糖DMEM(Gibco)、1MB．甘油磷酸钠(Sigma)、5mg／ml地塞米松(Sigma)、25ug／mlVc(

8、Sigma)、胰岛素(Gibco)、20mM吲哚美辛(Sigma)、6内蒙古大学硕士学位论文bFGF(Gibco)、1OOx谷氨酰胺(Gibco)、1OOx丙酮酸钠