sox9基因真核表达载体的构建及其诱导大鼠骨髓基质细胞定向分化为骨骺干细胞

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1、Sox9基因真核表达载体的构建及其诱导大鼠骨髓基质细胞定向分化为骨骺干细胞：胡伟华,陈安民,郭风劲,李锋,黄晖,张伟凯【摘要】［目的］从永生化骨骺干细胞中克隆Sox9基因并构建真核表达载体，并探讨Sox9诱导骨髓基质细胞向骨骺干细胞分化的可能性。［方法］以RTPCR方法获得Sox9全长，插入pGEMTEasy克隆载体中，测序正确后与pEGFPIRES2表达载体酶切后连接，复合质粒以脂质体法转染骨髓基质细胞，观察转染效率，Sox9和FGFR3的表达。流式细胞术鉴定细胞表型，MTT法检测细胞增殖活性。［结果］成功的完成了Sox9的扩增和表达载体的构建,重组

2、载体转染骨髓基质细胞后能检测到Sox9、FGFR3的表达，增殖活性与骨骺干细胞无异。［结论］成功构建了Sox9真核表达载体，其能诱导骨髓基质细胞分化为骨骺干细胞并具有其特性。【关键词】骨骺干细胞；Sox9；骨髓基质细胞；转染Abstract：［Objective］ToconstructeukaryoticexpressionvectorcontainingSox9derivedfromimmortalizedprecartilaginousstemcellsandtoprobeitsinductiveeffectonmarroacellsdifferenti

3、atingintoprecartilaginousstemcells.［Method］Sox9arroacells.TheexpressionofSox9andFGFR-3munohistochemisty.IdentificationandproliferationinedbyfloetryandMTT.［Result］Sox9cloningandexpressionvectorconstructionarroacellsaftertransfection,ilartoprecartilaginousstemcells.［Conclusion］Sox9euk

4、aryoticexpressionvectorhasbeensuccessfullyestablished.Sox9caninducemarroacellstodifferentiateintoprecartilaginousstemcells.Keycells;Sox9;marroacells;transfection骨骺干细胞（precartilaginousstemcells,PSCs）是控制生长期动物肢体生长、能定向分化的成体干细胞［1］。它作为组织工程的种子细胞，可用于软骨与骨缺损的细胞替代治疗［2］。PSCs第5代即开始分化，且取材困难，原代细胞培

5、养技术尚不能在体外获得大量表型一致的PSCs［3］。将容易的骨髓基质细胞（marroacells,MSCs）诱导分化至PSCs，有望解决此难题。而Sox9抑制骨骺细胞的终末期分化，延长软骨的成熟过程并抑制其凋亡。为此，笔者构建真核表达载体pEGFPIRES2Sox9，并转染MSCs，以期诱导分化为PSCs，为研究骨骺细胞分化机制及组织工程提供稳定的细胞。1材料和方法1.1实验材料及主要试剂永生化骨骺干细胞株、菌种E.coliDH5α由同济医院骨科实验室保存，DMEM/F12培养基和胎牛血清（Gibco），TrizolReagent（Toyobo），兔多克

6、隆抗体FGFR3/c15（SantaCruz），RTPCR试剂盒（Toyobo），BamHI、EcoRI、pGEMTEasy（Promega），pEGFPIRES2（Initrogen）,LipofectamineTM2000（Invitrogen）,Ⅱ型胶原及X型胶原抗体（Promega），一抗兔抗鼠CD44、CD45、CD34及二抗AlexaFluorgoatantirabitIgG(Sigma)。1.2引物设计根据GeneBank(NM012636)序列编码区自行设计引物（分别含BamHI和EcoRI酶切位点），由上海英骏生物公司合成，上游序

7、列为：5'ATGGAAATCACGGAAGAGCGTC3，下游序列为：5'GTGCTGAAGGGCTACGACTGGA3。1.3方法1.3.1Sox9基因的RTPCR取第3代IPSCs约106数量级，按TrizolReagentKit说明书操作，一步法提取总RNA，测浓度后取约2μg总RNA作为逆转录模板，根据逆转录试剂盒操作说明合成cDNA第1链，PCR反应：95℃预变性5min，94℃变性1min；62℃退火45s；72℃延伸50s；经35个循环，72℃延伸10min。取5μL反应产物，以0.2%琼脂糖凝胶电泳，初步鉴定扩增产物。1.3.2Sox

8、9克隆载体的构建和测序经PCRBios