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《临床医学论文-Sox9基因真核表达载体的构建及其诱导大鼠骨髓基质细胞定向分化为骨骺干细胞.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、临床医学论文・Sox9基因真核表达载体的构建及其诱导大鼠骨髓基质细胞定向分化为骨聽干细胞作者：胡伟华，陈安民,郭风劲，李锋，黄晖，张伟凯【摘要】［1-1的］从永生化骨肪干细胞屮克隆Sox9基因并构建真核表达载体,并探讨Sox9诱导骨髓基质细胞向骨飾干细胞分化的对能性。［方法］以RTPCR方法获得Sox9全长，插入pGEMTEasy克隆载体屮，测序正确后与pEGFPIRES2表达载体酶切后连接，复合质粒以脂质体法转染骨髓基质细胞，观察转染效率，Sox9和FGFR3的表达。流式细胞术鉴定细胞表型，MTT法检测细胞增殖活性。［结果］成
2、功的完成了Sox9的扩增和表达载休的构建，重组载体转染骨髓基质细胞后能检测到Sox9、FGFR3的表达，增殖活性与骨飾干细胞无异。［结论］成功构建了Sox9真核表达载体，其能诱导骨髓基质细胞分化为骨肪干细胞并具有其特性。【关键词】骨飾干细胞；Sox9；骨髓基质细胞；转染Abstract：[Objective]ToconstructeukaryoticexpressionvectorcontainingSox9derivedfromimmortalizedprecartilaginousstemcelIsandtoprobeits
3、inductiveeffectonmarrowstromacellsdifferentiatingintoprecartilaginousstemcells・[Method]Sox9wasobtainedwithRT・PCRandtheninsertedintopGEM-TEasycloningvectors.pEGFPRES2・Sox9wasestablishedaftersequencing.Thenit'stransfectedintomarrowstromacells.TheexpressionofSox9andFGFR
4、・3wasdetectedbyWestern・blolandimmunohistochemisty.Identificationandproliferationwasdeterminedbyf1owcytometryandMTT.[Result]Sox9cloningandexpressionvectorconstructionwasachieved・Sox9andFGFR・3expressionwasidentifiedinmarrowstromacellsaftertransfection,whoseproliferatio
5、nactivitywassimilartoprccartilaginousstemcells.[Conclusion]Sox9eukaryoticexpressionvectorhasbeensuccessfullyeslablished・Sox9caninducemarrowstromacclIstodifferentiateintoprccartilaginousstemcells・Keywords：prccartilaginousstemcells;Sox9;marrowstromacells;transfection骨肪
6、T•细胞(precartilaginousstemcelIs,PSCs)是控制生长期动物肢体生长、能定向分化的成体干细胞[1]。它作为组织工程的种子细胞，可用于软骨与骨缺损的细胞替代治疗[2]。PSCs第5代即开始分化，且取材困难，原代细胞培养技术尚不能在体外获得大量表型一致的PSCs[3]。将来源容易的骨髓基质细胞(mai-TowsIromacelIs,MSCs)诱导分化至PSCs,有望解决此难题。IfuSox9抑制骨肪细胞的终末期分化，延长软骨的成熟过程并抑制其凋亡。为此,笔者构建真核表达载体pEGFPTRES2Sox9,并
7、转染MSCs,以期诱导分化为PSCs,为研究骨飯细胞分化机制及组织工程提供稳定的细胞来源。1材料和方法1・1实验材料及主要试剂永生化骨丽干细胞株、菌种E・coliDH5Q由同济医院骨科实验室保存,DMEM/F12培养基和胎牛血清(Gibco),Trizo1Reagent(Toyobo),兔多克隆抗休FGFR3/c15(SantaCruz),RTPCR试剂盒(Toyobo),BamHhEcoRT>pGEMTEasy(Promega),pEGFPTRES2(Initrogen),LipofectamineTM2000(Invitro
8、gen),II型胶原及X型胶原抗体(Promega)>一抗兔抗鼠CD44、CD45、CD34及二抗AlexaFluorgoatantirabitTgG(Sigma)o1.2引物设计根据GcncBank(NMO12636)序列编码区自行设计引物(分别含BamHI和
