鼠骨骺增殖区细胞的分离鉴定和克隆构建pthrp基因真核表达载体

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1、鼠骨骺增殖区细胞的分离鉴定和克隆构建PTHrp基因真核表达载体作者黄仕龙　陈安民　郭风劲　张衣北【关键词】殖区软骨细胞,摘要：［目的］分离、鉴定大鼠骨骺生长板增殖区软骨细胞，克隆甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrp）基因并构建真核表达载体pEGFPIRES2PTHrp。［方法］Percoll不连续密度梯度离心法分离生长板增殖区软骨细胞，用X型胶原抗体和电镜鉴定，提取总RNA，RTPCR方法获得PTHrp基因的全长cDNA，插入pCR21TA克隆载体中进行序列测定，测序正确后将其亚克隆至表达载体pEGFPIRES2。［

2、结果］分离出增殖区软骨细胞，经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒。［结论］准确分离增殖区软骨细胞并成功构建了PTHrp基因的真核表达载体，为进一步揭示PTHrp的生物学功能及其在在软骨细胞的分化和骨骼形态发生中的作用奠定了基础。　　关键词：PTHrp基因；质粒；殖区软骨细胞；表达载体　　Identificationofepiphysealproliferatingzonecellsandconstructionofeukaryoticexpressionvectorcontaini

3、ngPTHrpgene　　Abstract：［Objective］Toseparatesproliferatingzonecellsfromthegroonerelatedpeptidegene(PTHrp)andconstructitseukaryoticexpressionvector［Method］AftercentrifugationthroughadiscontinuousPercollgradient,thethirdandfourthfractionscellpopulationsofgroicro

4、scopeimageThetotalRNAcellsafteridentificationandthefulllengtheDNAencodingPTHrpgeneethodandinsertedintopCR21TAcloningvectorAfterthesequencinged,thegenegroedigestionanalysisandsequencingshoidcontainingPTHrpgeneaybeapromisingforstudyingthebiologicalfunctionofthe

5、PTHrpgeneanditsroleinchondrocytedifferentiationandboneformation　　Keyid;GroHI、EcoRl、TaqDNA合成酶，购自MBIFermentas公司，T4DNA连接酶购自Promega公司，兔抗鼠anticollagentypeX购自Calbiochem公司，PCRcleanupkit、NDAExtractionKit、PlasmidlsolationKit购自上海华舜公司，SP9000免疫组化试剂盒、ZLI9032浓缩型DAB试剂盒购自北京中

6、杉金桥公司。　　112引物设计　　根据GeneBank(NM012636)序列编码区自行设计上下游引物，由上海生工工程公司合成，上游序列为：5′CGGAATTCTGGAGGCGCTGATTCCTACA3′，下游序列为：5′CGGGATCCAACGTGTCCTTGGAAGATCT3′。　　12方法　　121骨骺生长板增殖区软骨细胞的取材参考靳小兵〔1〕，BarbaraDBoyan等〔2〕的方法并做适当改良。无菌分离新生SD大鼠股骨和胫骨，去除软组织，锐性分离骨骺与骨干之间膨大、半透明组织置DMEM／F12培养基中，

7、充分剪碎37℃孵育过夜。根据Ju¨rgenEM／F12洗涤，001％胶原酶P37℃温和振荡消化过夜，继以01％胶原酶P37℃处理4h以充分释放细胞。40目筛网过滤、洗涤后以含001％DNA酶I的培养基重悬细胞，小心移至预先配置的不连续percoll密度梯度液顶层，400g离心1h，取第4层细胞(密度约为1053g／ml)观察(图1)、计数后接种于含10％FBS、50μg／mlVitC的DMEM／F12培养基中，5％CO2，100％湿度，37℃培养24h后换液，以后每72h换液1次，细胞融合至75％～80％传代。取

8、传第4代细胞鉴定(图2)〔3〕。　　122增殖区软骨细胞的鉴定　　取第4代细胞，以104／ml的密度接种于24孔板，培养3~5d，细胞爬片后按SP试剂盒的方法固定、漂洗、破膜，anticollagentypeX孵育，DAB显色，常规脱水、透明、封片后观察(图3)。取生长良好的第4代细胞，常规方法制备透射电镜标本(图4)。　　123PTHrp基因的克隆　　取第4代软骨细胞约