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大鼠骨髓基质干细胞体外培养及成骨诱导分化【摘要】目的:研究大鼠骨髓基质干细胞体外培养的方法及成骨能力。方法:通过密度梯度离心法分离成年大鼠骨髓基质干细胞,检测细胞表面标志、定向成骨分化和细胞矿化作用。结果:原代培养大鼠骨髓基质干细胞通过3~5代传代,细胞形态趋于一致,诱导条件下出现矿化结节。结论:大鼠骨髓基质干细胞体外培养可模拟成骨分化过程,可作为骨组织工程研究的细胞学模型。【关键词】骨髓基质干细胞;诱导分化;成骨细胞【中图分类号】R414.1【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2010)009-0010-01骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalstemcells,BMSCs)是一类具有分化潜能的成体干细胞,在特定条件下可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞、神经细胞等多种细胞,被认为骨组织工程中的最佳种子细胞。本实验通过贴壁培养法和密度梯度离心法分离成年大鼠骨髓基质干细胞,定向成骨分化,并检测细胞表面标志、碱性磷酸酶活性和细胞矿化作用。材料和方法1材料6 1.1实验动物。成年wistar大鼠,雌雄不限,体重150~180g,由浙江大学华家池动物实验中心提供。1.2实验试剂。胎牛血清,胰蛋白酶(Hyclone),(杭州四季清生物技术有限公司),B一甘油磷酸纳(Sigma,USA),地塞米松(Sigma,USA),维生素C(Sigma,USA),小鼠抗大鼠OC单克隆抗体(R-D,USA),兔抗大鼠CD4(BA0532)、CD44(BA0321)、CD54(BA0541)、CD105(BA1725)、Fibronectin(BA1772)、CollagenⅠ(BA0325)、EGFR1(B0485)亲和纯化抗体(武汉博士德公司)2方法2.1BMSCs的分离和培养:成年wistar大鼠麻醉后处死,无菌条件下取股骨.用含10%FBS的高糖DMEM培养液冲洗骨髓腔.制成骨髓单细胞悬液。接种于培养皿中,置37℃、5%CO2培养。于72h半量更换培养液,以后每3d半量换液1次。加入成骨诱导培养液进行分化培养.对照组加入等量基础培养液。2.2免疫细胞化学检测rBMSCs的表面标志:取生长良好的3~5代rBMSCs以1.2×105/ml细胞悬液以1ml接种于盖玻片,待细胞单层融合至65%左右时,细胞爬片采用SP检测。2.36 rBMSCs成脂向诱导分化:取生长良好的3~5代rBMSCs接种培养,贴壁24h后换用成脂诱导剂,取诱导30d后的细胞进行苏丹Ⅳ染色。2.4rBMSCs骨向诱导分化:取生长良好的3~5代rBMSCs接种培养,贴壁24h后换用成骨诱导剂,取诱导15d、30d后的细胞进行矿化结节染色。3结果3.1原代培养的BMSCs接种24h后,即出现零星贴壁细胞。72h后开始增殖,生长良好,贴壁较均匀。BMSCs呈纺锤状,有突起。约10d时,细胞汇合成片,其融合率可达到80%~90%,有接触抑制现象。3.2rBMSCs表达出许多的非特异性的表面标志物。DAB显色CD44、CD54、CD105、Fibronectin、CollagenⅠ、EGFR1阳性,CD34阴性。3.3rBMSCs脂向诱导分化培养中细胞形态出现明显的变化:扁平,多为原盘状,可见细胞突起。细胞诱导10d后胞浆中出现致密的黑色点状物,被大量的“小白点”状的脂滴前体分割。14d后,出现少量高折光性脂滴,随着时间推进,不断增多并形成大脂滴。绿色滤光片下可见清晰的脂滴;苏丹Ⅳ染色显示红色脂滴。3.4rBMSCs骨向诱导分化培养中,诱导15d就有较多高折光性小颗粒沉积,并可见局部融合,30d时,可见大量结节,几乎覆盖整个细胞层。4讨论6 骨髓基质细胞又被称为“间充质干细胞”或“骨源性干细胞”。近年来研究发现还可以分化为星形胶质、少突胶质细胞及神经元,所以又称为多潜能成体干细胞。分离骨髓间充质干细胞有多种方法:免疫磁珠分离法[1]和流式细胞仪法[2]因费用高、需骨髓量大、操作复杂而较少应用。全骨髓法[3]即贴壁细胞分离法虽方法简单但所获细胞纯度不高;密度梯度离心法[4]是根据骨髓中各细胞成分比重不同离心分离培养,简单易行,所获得的细胞纯度较高。本实验选用密度梯度离心法分离培养的细胞经过3~5代的传代,细胞形态趋于一致;免疫荧光检测显示培养的细胞CD44、CD54、CD105、Fibronectin、CollagenⅠ、EGFR1阳性,CD34阴性。于文献报道[5]相一致。虽然这些不是特异性的细胞表面标志物,但可以用以鉴别参考。多向分化潜能是骨髓基质干细胞最重要的生物学特性[6~7]。本研究表明分离培养的细胞在体外诱导的情况下,既可以诱导为脂肪细胞,又可以诱导成为成骨细胞。因此,体外诱rBMSCs骨向分化可以很好地模拟骨髓基质干细胞向骨祖细胞、成骨前体细胞、成骨细胞、骨细胞分化的整个过程,是体外研究成骨功能及骨代谢的理想细胞生物模型。参考文献[1]EncinaNR,BillotteWG,HofmannMC.Immunomagneticisolationofosteoprogenitorsfrom6 humanbonemarrowstroma[J].LabInvest,1999;79(4):449-457[2]ZoharR,SodekJ,MccullochCA.Characterizationofstromalprogenitorcellsenrichedbyflowcytometry[J].Blood,1997;99(9):3471-3481[3]FriedensteinAJ,ChailakhyanRK,GerasimovUV.Bonemarrowostogenicstemcells:invitrocultivationandtransplantationindiffusionchambers[J].CellTissueKinet,1987,20(3):263-272[4]MajumderMK,ThiedeMA,MoscaTD,etal.Phenotypicandfunctionalcomparisonofcultureofmarrow-derivedmesenchymalstemcellsandstromalcells[J].CelluarPhysiology,1998;176(1):57-66[5]MartinDR,CoxNR,HathcockTL,etal.Isolationandcharaerizationofmultipotentialmesenchymalstemcelllsfromfelinebonemarrow[J].ExpHemtol,2002,30(8):879-886[6]VerfaillieCM.Adultstemcells:assessingthecaseforpluripotency[J].TrendsCellBiol,2002;12(11):502-5086 [7]DeansRJ,MoseleyAB.Mesenchymalstemcells:biologyandpotentialclinicaluses[J].ExpHematol,2000;28:875-884作者单位:318000浙江省台州市立医院6
