成人骨髓基质干细胞体外培养及体内成骨的实验研究

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1、第一军医大学硕士学位论文成人骨髓基质干细胞体外培养及体内成骨的实验研究姓名：任高宏申请学位级别：硕士专业：骨外科学指导教师：裴国献20030601第一萃趿夫学溪{=婿究生学校论文英文缩写ALpBrdUCHAD醚瓣畦DMSOFBSFCMFITCGFP珏毽§dSeHEIPCMKbM鞭OCNoDpE露姜≯e霁SEMTEM英文臻咯谲表

2、albovineSelalmflowcytometerfluoresceinisothiacyanategreenfluorescentproteinhumanbonemarrowsta'omalcellshematoxylinandeosininvertedphasecontrastmicroscopekilo-basepairmethyttetemzolium；3-(4，5-dime啦ylthiazoi-zy：)-2,5-diphenyRerazolimnbromideosteoealcinopfiealdensityphyeoerythrinphycoery

3、thrinr舀Fel"se矗'anseriplion-polymcrasechainreactionscanningelectronmicroscopetransmissionelectronmicroscope．1．中文全称溅淫臻酸酶5漠坨脱氧尿替珊瑚羧基磷灰石DMED琏莽蒸二帮蘩噩碾麓牛斑滚流式缀照彼异硫氰酸荧光豢绿色荧光蛋囟A嚣熊纂震予镪鼹HE染色倒置棚麓最微镜子骧麓对噻躞蕊曹锈素光密度藻绂爨囊逆转录累合黪链爱驻扫描电子显微镜透射瞧予鑫徽镜第一军医大学硕十研究生学位论文成人骨髓基质干细胞体外培养及体内成骨的实验研究(中文摘要)由创伤、感染、肿瘤引起的骨缺损是

4、骨科临床治疗的棘手问题，采用传统的自体骨或同种异体骨移植及生物材料填充，由于存在种种弊端，治疗效果均不理想，限制了其临床广泛应用。组织工程技术的兴起为解决这一难题提供了新的思路，成为近年的研究热点。其中种子细胞与生物材料是组织工程研究的核心问题。本研究将成人骨髓基质干细胞(humanbonemarrowstromalcells，HBMSC)在体外培养并诱导分化为成骨细胞后，与珊瑚羟基磷灰石(coralhydroxyapafite，CHA)复合培养，观察其在体外生长情况，并将复合物植入裸鼠体内，观察其异位成骨能力；此外，还采用绿色荧光蛋白(greenfluoresc

5、entprotein,GFP)基因转染骨髓源成骨细胞作为示踪标记，为进一步研究提供实验依据。【目的】(1)将来源于成人骨髓、具有多向分化潜能的骨髓基质于细胞，在特定的条件下定向诱导分化为成骨细胞，观察其生物学特性，探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性和应用价值。(2)观察HBMSC与CHA在体外复合培养条件下的生长情况及生物相容性，为骨组织工程选择适宜的种子细胞载体。(3)研究成骨细胞在CHA支架材料上复合培养后构建的组织工程化骨组织的体内异位成骨能力，探讨适宜的组织工程化骨组织的构建方式。(4)观察经腺病毒介导的GFP转染的成骨细胞的生物学特性，探讨GFP作为组

6、织工程种子细胞示踪剂的可行性。【方法】(1)抽取健康成人骨髓采用全骨髓法进行培养扩增，传代后改用含第一军医大学硕士研究生学何论文地塞米松(10‘8mol／L)、B一甘油磷酸钠(10mmol／L)和维生C(50mg／L)的条件培养基促使其向成骨细胞定向诱导分化。在相差显微镜、HE染色光镜、扫描与透射电镜下观察细胞形态及超微结构，并测定培养细胞的生长曲线(MTT法)，流式细胞术进行细胞表面特征鉴定，免疫组化检测I型胶原，Gomori钙钴法进行ALP染色、VonKossa法进行钙结节染色，同时测定细胞内ALP含量变化。(2)将已定向诱导分化的成人成骨细胞单独或与CHA复

7、合培养，不同时间用倒置相差显微镜、HE染色光镜及扫描电镜观察，MTT法测定细胞生长曲线，并进行细胞微量蛋白含量和碱性磷酸酶的定量检测。(3)将已定向诱导分化的成人成骨细胞种植于CHA上，复合培养5～7d后植入裸鼠体内，4、8、12周取材作一般观察、x线摄片观察、组织学检查和源于成人的ALP及OCN的RT．PCR检测。(4)以腺病毒为载体，293A细胞为包装细胞，介导GFP转染成人骨髓源成骨细胞，在相差显微镜和荧光显微镜下观察，流式细胞术检测其表达效率：并将转染后的成骨细胞植入裸鼠肌袋内，2周和4周后取材进行检测。【结果】(1)原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力

8、，诱导培养