兔骨髓基质干细胞与软骨细胞共培养体内成软骨的实验观察

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1、兔骨髓基质干细胞与软骨细胞共培养体内成软骨的实验观察作者：倪云峰，李小飞，刘源，雷战军，卢强【关键词】软骨细胞Experimentalstudyonchondrogenesisbycocultureofrabbitmesenchymalstemcellsandchondrocytes　　【Abstract】AIM:Toexplorethefeasibilityofinvivochondrogenesisbycocultureofmesenchymalstemcells(MSCs)andchondrocytes.METHODS:RabbitMSCsandchond

2、rocytesixedataratioof3∶1(MSCs∶chondrocytes).Themixedcellsateconcentrationof6.0×1010/Lascoculturegroup.MSCsandchondrocytesofthesameultimateconcentrationensaintaintheoriginalsizeandshapeduringinvivocultureandformedhomogenousmaturecartilageafter8ore,theneocartilagesinbothgroupsilartoeac

3、hotheringrossappearanceandhistologicalfeatures.Innegativecontrolgroup,thecartilageedbuttheconnectivetissue.CONCLUSION:ChondrocytescanprovideachondrogenicmicroenvironmenttoinduceachondrogenicdifferentiationofMSCsandthuspromotethechondrogenesisofMSCsinvivo.　　【Keyesenchymalstemcells，MSC

4、s）是一类具有多向分化潜能的干细胞，在体外特定的诱导条件下可分化为骨、软骨等组织［3-4］.诱导因子及软骨微环境是影响MSCs成软骨分化及软骨形成的主要因素.我们利用少量软骨细胞，通过共培养方法诱导MSCs在体内形成成熟的软骨组织，为进一步的实验研究提供理论依据.　　1材料和方法　　1.1材料新西兰兔15只，5～6mo龄，雌雄不限，体质量(2.5±0.5)kg；新生新西兰兔2只（第四军医大学实验动物中心）；DMEM培养液、胎牛血清（Gibco）；胰蛋白酶（Sigma）；II型胶原酶（Promega）；PGA（上海易括公司）；倒置显微镜（IX71，Olympus）

5、；CO2孵箱（日本三洋，MCO175型）.　　1.2方法　　1.2.1兔MSCs的分离培养将出生1～3d的新西兰兔处死，无菌操作下取其四肢的长骨，用注射器抽取长骨内骨髓，加含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基吹打制成单细胞悬液，分装于2个25mL培养瓶中，取少量细胞计数.在37℃,5mL/LCO2及饱和湿度条件下静止培养5d.第6日首次细胞换液，以后每2～3日换液1次.待第10～14日贴壁细胞长满瓶底部后用2.5g/L胰蛋白酶和1mL/LEDTA的混合溶液消化并传代培养细胞.　　1.2.2兔软骨细胞的分离与培养将出生1～3d的新西兰兔处死，在无菌操作下从其四

6、肢的关节中取出软骨，将软骨切成1～3mm3大小置无菌试管，PBS冲洗3次，800r/min离心3min，吸去PBS，加2g/L胰酶4mL，置5mL/LCO2孵箱30min，吸出胰酶后再加入2g/LII型胶原酶5mL，置孵箱内消化6~8h.观察大部分软骨块被消化后，收集消化液，800r/min离心3min，用培养液洗2次.细胞记数后移入25mL培养瓶中，使细胞密度为2×104/L，加DMEM培养液(含100mL/L胎牛血清，1×105U/L青霉素，50mg/L维生素C，0.15g/L谷氨酰胺)，于37℃，5mL/LCO2孵箱中培养，每2日换液1次.原代细胞贴壁并融

7、合成单层后传代培养.　　1.2.3聚羟基乙酸（PGA）支架的处理PGA无纺网支架材料的纤维直径15μm，平均间距150～200μm，孔隙率97%，厚2mm.将PGA支架切成5mm×5mm大小，750mL/L乙醇浸泡12h，无菌PBS冲洗3遍，放入90mm无菌培养皿中干燥，用前用紫外线照射30min.　　1.2.4细胞与PGA支架的复合将MSCs与软骨细胞按3∶1比例混匀，调整细胞密度为6.0×1010/L.将混合细胞、软骨细胞及MSCs分别接种于经培养液预湿的塑形PGA上，以细胞悬液刚好不溢出材料为宜.在37℃，5mL/LCO2，饱和湿度培养箱中孵育4h，然后在

8、复合物周围滴加含100m