兔骨髓基质干细胞与软骨细胞共培养体内成软骨的实验观察论文

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1、兔骨髓基质干细胞与软骨细胞共培养体内成软骨的实验观察论文倪云峰，李小飞，刘源，雷战军，卢强【关键词】软骨细胞Experimentalstudyonchondrogenesisbycocultureofrabbitmesenchymalstemcellsandchondrocytes【Abstract】AIM:Toexplorethefeasibilityofinvivochondrogenesisbycocultureofmesenchymalstemcells(MSCs)andchondrocytes.METHODS:RabbitMSCsandchondrocytesix

2、edataratioof3∶1(MSCs∶chondrocytes).Themixedcellsateconcentrationof6.0×1010/Lascoculturegroup.MSCsandchondrocytesofthesameultimateconcentrationensaintaintheoriginalsizeandshapeduringinvivocultureandformedhomogenousmaturecartilageafter8ore,theneocartilagesinbothgroupsilartoeachotheringrossap

3、pearanceandhistologicalfeatures.Innegativecontrolgroup,thecartilageedbuttheconnectivetissue.CONCLUSION:ChondrocytescanprovideachondrogenicmicroenvironmenttoinduceachondrogenicdifferentiationofMSCsandthuspromotethechondrogenesisofMSCsinvivo.【Keyesenchymalstemcells，MSCs）是一类具有多向分化潜能的干细胞，在体外特定

4、的诱导条件下可分化为骨、软骨等组织［3-4］.诱导因子及软骨微环境是影响MSCs成软骨分化及软骨形成的主要因素.我们利用少量软骨细胞，通过共培养方法诱导MSCs在体内形成成熟的软骨组织，为进一步的实验研究提供理论依据.1材料和方法1.1材料新西兰兔15只，5～6mo龄，雌雄不限，体质量(2.5±0.5)kg；新生新西兰兔2只（第四军医大学实验动物中心）；DMEM培养液、胎牛血清（Gibco）；胰蛋白酶（Sigma）；II型胶原酶（Promega）；PGA（上海易括公司）；倒置显微镜（IX71，Olympus）；CO2孵箱（日本三洋，MCO175型）.1.2方法1.2.1兔M

5、SCs的分离培养将出生1～3d的新西兰兔处死，无菌操作下取其四肢的长骨，用注射器抽取长骨内骨髓，加含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基吹打制成单细胞悬液，分装于2个25mL培养瓶中，取少量细胞计数.在37℃,5mL/LCO2及饱和湿度条件下静止培养5d.第6日首次细胞换液，以后每2～3日换液1次.待第10～14日贴壁细胞长满瓶底部后用2.5g/L胰蛋白酶和1mL/LEDTA的混合溶液消化并传代培养细胞.1.2.2兔软骨细胞的分离与培养将出生1～3d的新西兰兔处死，在无菌操作下从其四肢的关节中取出软骨，将软骨切成1～3mm3大小置无菌试管，PBS冲洗3次，800r/min

6、离心3min，吸去PBS，加2g/L胰酶4mL，置5mL/LCO2孵箱30min，吸出胰酶后再加入2g/LII型胶原酶5mL，置孵箱内消化6~8h.观察大部分软骨块被消化后，收集消化液，800r/min离心3min，用培养液洗2次.细胞记数后移入25mL培养瓶中，使细胞密度为2×104/L，加DMEM培养液(含100mL/L胎牛血清，1×105U/L青霉素，50mg/L维生素C，0.15g/L谷氨酰胺)，于37℃，5mL/LCO2孵箱中培养，每2日换液1次.原代细胞贴壁并融合成单层后传代培养.1.2.3聚羟基乙酸（PGA）支架的处理PGA无纺网支架材料的纤维直径15μm，平

7、均间距150～200μm，孔隙率97%，厚2mm.将PGA支架切成5mm×5mm大小，750mL/L乙醇浸泡12h，无菌PBS冲洗3遍，放入90mm无菌培养皿中干燥，用前用紫外线照射30min.1.2.4细胞与PGA支架的复合将MSCs与软骨细胞按3∶1比例混匀，调整细胞密度为6.0×1010/L.将混合细胞、软骨细胞及MSCs分别接种于经培养液预湿的塑形PGA上，以细胞悬液刚好不溢出材料为宜.在37℃，5mL/LCO2，饱和湿度培养箱中孵育4h，然后在复合物周围滴加含100mL/L胎牛血清DMEM培养液4mL，继