兔骨髓基质干细胞的体外培养及生物学活性研究

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1、兔骨髓基质干细胞的体外培养及生物学活性研究作者：张晨，王坤正，强辉，时志斌，党晓谦，黄向辉【摘要】　　目的体外分离培养、鉴定兔骨髓基质干细胞(BMSCs)并探讨其分化潜能。方法应用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法，体外分离培养兔骨髓来源的骨髓基质干细胞，培养过程中倒置显微镜下观察其生物学特性，HE染色和CD34、CD44免疫组织化学染色行细胞学鉴定；应用体外成骨与成脂诱导分化检测其生物学活性。结果体外实验成功分离培养兔BMSCs，HE染色显示细胞均一性好；CD44强阳性表达，CD34阴性表达。诱导成骨结果显示BMSCs具

2、有较强的成骨活性，ALP染色阳性；成脂诱导结果显示BMSCs具有较强的成脂活性，油红“O”脂肪染色阳性。结论BMSCs体外具有潜在的多向分化能力。【关键词】骨髓基质干细胞；细胞培养；多向分化　　ABSTRACT:ObjectiveToobservetheeffectoftheinvitroisolation,cultureandidentificationofrabbitbonemarrowderivedmesenchymalstemcells(BMSCs)andexplorethedifferentiationpo

3、tentialsofBMSCs.MethodsBMSCswereisolatedandpurifiedbydensitygradientcentrifugation13combinedwithattachmentculturemethod.ThebiologicalcharacteristicsofBMSCswereobservedunderaninvertedmicroscope.TheBMSCswereidentifiedwithHEstainingandCD34/CD44immunohistochemicalst

4、aining.ThebiologicalactivityofBMSCswasdetectedbyosteogenicinductionandsteatogenicinduction.ResultsBMSCswereisolatedsuccessfullyinvitroandhadgoodhomogenicity.ImmunohistochemicalstainingofCD34/CD44showedstrongpositiveexpressionofCD44andnegativeexpressionofCD34.For

5、tisosteogenicabilityandpositivestainingofALPcouldbedetectedbyosteogenicinduction,andfortissteatogenicabilityandpositivestainingofaxungiacouldbedetectedbysteatogenicinduction.ConclusionBMSCshavethecapabilityofmultidirectionaldifferentiationinvitro.　　KEYWORDS:bon

6、emarrowderivedmesenchymalstemcell;cellculture;multidirectionaldifferentiation　　基因治疗过程中目的基因感染的靶向性成为基因工程研究的关键环节，选取何种目的细胞、组织作为基因感染的效应器是众多研究的核心。骨髓间充质干细胞(bonemarrowderivedmesenchymalstemcells,13BMSCs)是一种具有自我更新能力和多向分化能力的干细胞，在特定条件下可以向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱、脂肪细胞等分化。将编码与骨组织再生有

7、关的生长因子的基因片段转移到BMSCs中，既能够诱导其向成骨细胞转化，使之发挥种子细胞的作用，又能在体内骨组织再生过程中持续高效地分泌生长因子，有利于骨组织的再生修复和新骨形成。因此，将其作为基因治疗宿主细胞以及组织工程种子细胞已成为当前研究的热点。　　本实验应用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法，体外分离培养兔骨髓来源的BMSCs，培养过程中应用相差显微镜及HE染色观察细胞的贴壁、扩增、形态、生长速度及群体生长方式等特征，利用细胞表面抗原免疫组化染色鉴定及诱导成骨、成脂鉴定等方法鉴定培养的BMSCs的特征及纯度，为后续实

8、验提供充足的靶细胞支持。　　1材料与方法　　1.1实验材料　　2月龄纯种新西兰大耳白兔，雄性，体重1.5～2.5kg，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。胎牛血清、低糖DMEM培养基(LGDMEM)、胰蛋白酶、Percoll分离液(1.073g/mL)购自美国Gibco公司；CD34、CD44羊抗兔单克隆抗体、鼠抗羊IgGF