兔骨髓间充质干细胞体外培养及生物学特性研究论文

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1、兔骨髓间充质干细胞体外培养及生物学特性研究论文【摘要】目的：进一步研究兔骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）分离和培养方法及其生物学特性，为利用MSCs作为种子细胞治疗多种疾病提供实验基础。方法：通过密度梯度离心、贴壁筛选法分离培养兔MSCs。测定其接种贴壁率，在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化，利用甲基噻唑基四唑（methylthiazdyltetrazolium,MTT）法测定MSCs生长曲线，并应用流式细胞术测定细胞表面标记物。结果：MSCs接种12h后贴壁率为95%以上，细胞倍增时间约为30.8h，平均传代时间约5~7d；培养的MSCs阳性表

2、达CD29、CD44、CD105，阴性表达CD34。结论：在适宜的实验条件下.freelalStemCells〔Abstract〕ObjectiveTofurtherstudytheisolationandcultivationproceduresofmesenchymalstemcellsfromrabbitinvitro,andexploretheirbiologicalproperties.TobuildanexperimentalbasisonapplyingMSCsasseedcellstotreatmanydiseases.MethodsMSCstibiasbydensit

3、ygradientcentrifugationandicroscopeconsecutivelyandthecellgroeasuredbyMTTmethod.Cellcycleandsurfaceantigenseter.ResultsThesubculturedcellsshoakeitpossibletoMSCstobetheseedcellsfortissueengineering.〔Keyesenchymalstemcells;Biologicalcharacteristics;Cellculture干细胞是具有自我更新能力，且在适宜微环境下具有多系分化潜能的原始细胞1。近年

4、研究发现，机体内除胚胎干细胞外还存在具有自我更新和分化能力的成体干细胞。其中骨髓中的干/粒细胞包括间充质干细胞（Mesenchymalstemcells,MSCs），造血干细胞及网状内皮系统。MSCs可在体外扩增并有多向分化潜能2-4，且取材方便，免疫耐受性、遗传背景稳定及易于转染外源基因等，因而作为组织工程“种子细胞”有“广泛的应用前景”5-8。本实验通过对兔MSCs体外培养法及其生物学特性进行研究，以建立一套稳定、成熟的兔MSCs培养方法，从而为细胞移植等组织工程提供种子细胞来源提供实验基础。1材料及方法1.1主要试剂与仪器低糖DMEM培养基（GIBICO公司）、10%胎牛血清（H

5、yclone公司）、0.125%胰蛋白酶（Sigma公司）、Ficoll淋巴细胞分离液（上海华精生物高科技有限公司，比重1.077g/mL）、CD29、CD34、CD44、CD105单克隆抗体和FITC标记的二抗（Labvision）、MTT（沃宏公司）、倒置相差显微镜（OLYMPUS）、细胞培养箱（Forma）、流式细胞仪（FACSCalibur,BECTONDICKINSON公司，美国）及超净工作台（ESCO）等。1.2实验动物普通级健康新西兰大耳白兔，雌性，兔龄约3个月（南京市第一医院动物实验中心提供，许可证号：SCXK苏2002-2007）。1.3方法1.3.1骨髓MSCs的分

6、离纯化与培养兔仰卧固定于兔台上，予2%利多卡因局麻后，持16号骨穿针，沿胫骨平台垂直刺入骨髓腔，外接肝素（3000U，0.2mL）润洗过的10mL无菌注射器，抽取骨髓4mL，缓慢叠于等量Ficoll淋巴细胞分离液（密度1.077g/mL）上，以2000r/min的速度离心20min，分离骨髓单个核细胞，收集界面上的细胞，移入另一离心管，PBS洗涤，2000r/min离心5min，反复2次，弃上清，悬浮于含10%胎牛血清的DMEM培养基（青霉素100U/mL，链霉素100U/mL），轻轻吹打均匀，接种到25cm2培养瓶，置37℃，5%CO2及饱和湿度培养箱中培养。4~6d首次换液，以后每

7、3d或4d换液1次，14~21d细胞生长融合达80%以上，以0.125%胰蛋白酶消化，按1:2比例传代培养，倒置显微镜下逐日观察细胞形态。1.3.2骨髓MSC贴壁率检测取对数生长期细胞，0.125%胰蛋白酶消化制备单细胞悬液，调整细胞浓度为1×105/mL，接种于24孔培养板，每次孔1mL，每2h取出培养板，吸去4孔培养液，0.1mol/LPBS漂洗除去未贴壁细胞，0.125%胰蛋白酶消化后离心收集细胞，进行细胞计数，共观察12h，按以下公式逐