成人骨髓基质干细胞体外培养及定向诱导分化为成骨细胞

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1、成人骨髓基质干细胞体外培养及定向诱导分化为成骨细胞：滕勇，胡蕴玉，安书杰，戴先文，赵黎，白建萍，李旭升，吕荣【关键词】干细胞【Abstract】AIM:Tobuildamethodtoculturebonemarroesenchymalstemcells(MSCs)invitroandtoinvestigatethefeasibilityofinducingMSCsintoosteoblasts.METHODS:HumanMSCsadultbonemarroentformedafter7-10dandtheMSCsofthepa

2、ssage3odifiedcalciumcobaltstainingmethod,typeⅠcollagenandosteocalcinassaymunohistochemistryandcalciumnodeassayogeneousMSCsnodesadultbonemarroarrocells;adult;tissueengineering;osteogenesis/drugeffects　　【摘要】目的：建立成人骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养的方法，并探讨定向诱导分化为成骨细胞的途径.方法：抽取成人骨髓，Percol

3、l密度梯度离心法进行体外培养，贴壁细胞传代，取第3代细胞在培养基中添加成骨诱导剂地塞米松、β甘油磷酸、维生素C，培养15d后，在倒置显微镜观察细胞形态，钙－钴法染色检测碱性磷酸酶（ALP）表达，免疫组化（SABC法）检测Ⅰ型胶原、骨钙素表达，茜素红染色检测钙结节形成.结果：Percoll密度梯度离心法培养可获得均一的MSCs；诱导分化的MSCs呈典型的成骨细胞形态；ALP染色阳性率可达81%以上；Ⅰ型胶原、骨钙素表达阳性；茜素红染色见钙结节形成.结论：可以从成人骨髓中培养出MSCs，并可定向诱导分化为成骨细胞，可用作临床骨组织工

4、程种子细胞.　　【关键词】骨髓，干细胞；成年人；组织工程；骨生成/药物作用　　0引言　　种子细胞、支架材料、生长因子是组织工程的三大要素，寻找合适的种子细胞是成功的重要因素［1］.目前骨组织工程种子细胞主要有骨、骨膜、骨髓和其他非骨组织.骨髓基质干细胞（marroesenchymalstemcells,MSCs）因其充足，取材方便安全，便于培养和基因修饰，增生活跃、多向分化及成骨能力确切［2-4］，从而受到广泛关注，具有广泛的应用前景.自从Maniatopoulos等［5］1988年首次报道鼠MSCs经体外培养可形成钙化的骨样组

5、织以来，从动物骨髓诱导分化成骨细胞已不困难，人们目前已能从胎儿骨髓中分离出MSCs.成人骨髓中MSCs含量较少，能否分离、分离的方法如何是目前研究的方向.本研究在动物实验基础上建立临床成人MSCs的培养和诱导成骨的方法，为组织工程走向临床作准备.　　1材料和方法　　1.1材料　　骨髓取自5例骨科取髂骨患者，年龄分别为28,30,35，55,60岁.2例诊断脊柱滑脱；3例诊断四肢骨不连接.5例均无代谢性骨病及结核，肝肾功能正常.经知情同意，术中取髂骨前从髂后上棘抽取骨髓5mL，吸入加有0.5mL肝素的20mL无菌注射器.主要试剂:

6、LDMEM低糖培养基、胰酶均为Gibco产品，胎牛血清为Hyclone产品，地塞米松、β甘油磷酸、维生素C均为Sigma产品，Percoll分离液Pharmacia产品.兔抗人Ⅰ型胶原多克隆抗体及免疫组化（SABC法）检测试剂盒为中山生物技术有限公司产品，鼠抗人骨钙素mAb为体美国BD公司产品，50mL一次性塑料培养瓶为美国Coster公司产品，噻唑蓝（MTT）为华美生物工程公司产品.完全培养基组成：LDMEM加入10mL/L胎牛血清，青、链霉素终浓度1667μkat/L.成骨诱导条件培养基：完全培养基加地塞米松、β甘油磷酸、维

7、生素C，终浓度分别为1×10-8mol/L,50mg/L,10mmol/L.　　1.2方法　　1.2.1成人MSCs原代培养MSCs的分离将抽取的骨髓加入装有5mL磷酸盐缓冲液（PBS）的离心管，吸管吹打混匀，800r/min离心10min，弃去上层7mL脂滴及上清，剩余上清与细胞混匀，沿管壁缓慢滴加底部装有Percoll（体积质量1.073kg/L）分离液的离心管中，900g离心30min，吸取界面云雾状白膜层，加入PBS，800r/min离心10min洗涤2遍，计数.2例55岁以上患者骨髓以4×107接种于50mL培养瓶，另

8、外3例以2×107接种于50mL培养瓶.5d后半量换液，第7~10日见有较多贴壁细胞后全量换液，此后2~3d换液1次，细胞90%汇合时2.5g/L胰酶消化1∶3传代.　　1.2.2成人MSCs向成骨细胞表型诱导取生长良好的第2代细胞，更换培养液为成骨条件培养液，