兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞的研究

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1、兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞的研究【摘要】目的探讨兔骨髓间充质干细胞﹙bonemarroesenchymalstemcells,BMSCs﹚体外分离培养、诱导分化为成骨细胞的方法，并研究其生物学特性。方法采用体外细胞培养技术自兔股骨、胫骨及肱骨中分离BMSCs进行纯化、培养。用地塞米松、β甘油磷酸钠、维生素C定向诱导BMSCs分化为成骨细胞，改良MTT法测定其生长曲线，NBT/BCIP染色法、P对硝基苯基质法及茜素红染色法检测BMSCs的成骨能力。结果成骨诱导1~5d，培养的细胞增殖旺盛，3~5d即可融合成单层，随着诱导时间的延长，细胞增殖速度

2、减慢，出现细胞聚集的现象，培养细胞逐渐汇合呈铺路石状，细胞形态变为胞体较小的立方形，继续诱导，可出现多角形成骨样细胞，胞外基质分泌逐渐增多，胶原堆积、钙盐沉积，10~12d形成不透光矿化结节，ALP活性增高，茜素红染色阳性，表示BMSCs向成骨细胞分化。结论兔BMSCs经体外分离、诱导培养，可以定向分化为成骨细胞。【关键词】骨髓间充质干细胞；诱导分化；成骨细胞【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheisolationandcultivationofbonemarroesenchymalstemcells﹙BMSCs﹚fromthe

3、bonemarrotodifferentiateintoosteoblastsinvitro.MethodsBMSCsthefemurs,tibiasandhumerusbonesoftherabbit,thenseparated,purifiedandproliferated.Afterprimaryculture,thesubculturedcellsediumincludingdexamethasone,βglycerophosphate,Lascorbicacid,thenstainedaryandpassagecultures.After8day

4、sofosteoblastinducing,theBMSCscongregated,shoedmineralizednodule.Theexpressionofalkalinephosphataseitteddifferentiation.【Keyarroesenchymalstemcells,induceddifferentiation,osteoblasts由于肿瘤、外伤和骨骼异常等原因引起的大段骨缺损往往需要骨的重建，目前常规的方法有自体或异体、异种骨移植，但都存在一定的问题和限制，难以完全满足临床需要。组织工程化骨组织的研究为骨缺损修复开辟了新的途径，

5、但是在骨组织工程产品进入临床应用前，尚存在一些障碍有待克服，其中如何获得大量种子细胞是目前面临的最关键性的制约因素。近年来干细胞尤其是骨髓间充质干细胞﹙BMSCs﹚的研究为解决这一难题提供了可能。BMSCs是位于骨髓基质中的一类中胚层的未分化细胞，具有很强的自我更新和多向分化潜能，在一定诱导条件下，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞和成肌细胞等，还可以分化为巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞和成纤维细胞等骨髓基质细胞，具有发育为骨、软骨、脂肪、肌肉、真皮及骨髓基质等中胚层组织的潜能［1~3］。此外，BMSCs具有取材容易，对机体损伤小，增殖力强，易稳定表达成骨细胞表型等

6、优点，因此可作为骨组织工程的较好的种子材料。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物：日本大耳兔12只，6~8周龄，雌雄不拘，体重（250±50）g，由昆明医学院实验动物中心提供。1.1.2试剂和药品：LDMEM(GIBCO)，HEPES(CXBIO)，胎牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶（BBI），EDTA(CXBIO)，MTT(SIGMA)，三联液（10％十二烷基硫酸钠，5％异丁醇，0.012mol/L盐酸），地塞米松（SIGMA），β甘油磷酸钠（中国医学科学院生物医学工程研究所），维生素C（CXBIO），NBT/BCIP染色试剂盒（SIGMA公司），

7、茜素红（上海化学试剂厂），ALP（日本和光纯药工业株式会社）。1.2方法1.2.1BMSCs的分离、原代和传代培养：耳缘静脉注入少许空气处死日本大耳兔，75%乙醇内浸泡10min后，无菌条件下逐层切开皮肤及皮下组织，剥离附着于四肢长骨的肌肉，完整切取双侧股骨、胫骨和肱骨，PBS冲洗3遍；将各长骨两侧干骺端切除，充分显露骨髓腔，用7号针头的注射器吸取不含血清的LDMEM培养基冲洗骨髓腔，从长骨的另一端收集冲洗出来的骨髓，用吸管轻轻吹打成细胞悬液，1000r/min离心5min，弃上清和脂肪，加入含20％FBS的LDMEM培养基吹打成细胞悬液，调整细胞密度至1

8、×106个/ml并接种于50ml培养瓶