自体富血小板血浆体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导为成骨细胞的研究

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缩略词mBMSCsCDD缩略词表Abbreviation英文全称中文全称alkalinephosphatase碱性磷酸酶bonemarrowmesenchymalstemcells骨髓间充质干细胞clusterofdifferentiationopticaldensity抗原分化簇光密度DMEM．F12Dulbecco’SmodifiedEagle’s／DMEM-F12培养基DMSODOPCsFBSFCMFITCHEICCIOPCsMSCsMTTNBCSPASPBSPRPH锄’S—F12mediunldimethylsulfoxidedeterminedosteogenicprecursorcellsfetalbovineserumflowcytometryfluoresceinisothiocyanatehematoxylinandeosinimmunocytochemicalstaininginducedosteogenicprecursorcellsmesenchymalstemcellsmethylthiazolyltetrazoliumnew-bomcalfserumperiodicacid—schiffphosphatebufferedsalineplatelet·richplasma二甲基亚砜定向性骨祖细胞胎牛血清流式细胞术异硫氰酸荧光素苏木精．伊红免疫细胞化学染色诱导性骨祖细胞间充质干细胞四甲基偶氮唑蓝新生牛血清过碘酸．希夫磷酸盐缓冲液富血小板血浆Ⅲ3洲3¨i¨¨¨i●1㈣5Ⅲ4哪8¨¨ii■●-ⅢY 徐州医学院硕士学位论文自体富血小板血浆体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导为成骨细胞的研究中文摘要骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)具有多向分化潜能，是目前常用的骨组织工程种子细胞。研究表明移植的BMSCs数量越多，临床疗效越好。但BMSCs局部数量少，需经过体外培养扩增才能保证疗效。当前常以异种血清作为培养基，如胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)和新生牛血清(new-borncalfserum，NBCS)，若用于临床，则存在伦理学争议、传播疾病和潜在抗原性等问题。富血小板血浆(platelet—richplasma，PRP)是自体全血提取物，可保证相对安全性，且含有多种生长因子。本实验尝试采用自体PRP替代异种血清体外培养兔BMSCs，观察PRP对BMSCs体外增殖和诱导成骨分化的影响，探讨促进BMSCs的增殖和分化的新方法。第一部分自体富血小板血浆对兔骨髓间充质干细胞体外增殖的影响目的用自体PRP体外培养兔BMSCs，探讨PRP在BMSCs体外培养增殖时对细胞生物学特性的影响。方法经兔耳中央动脉取血，两次离心法制备PRP。从兔髂骨穿刺抽取骨髓，密度梯度离心法富集BMSCs。将每只兔BMSCs分为PRP组、FBS组和无血清组，每组6例，分别采用10％自体PRP、10％FBS与无血清，配比DMEM．F12培养基和青、链霉素培养。观察细胞形态变化、检测各组细胞增殖活性并绘制生长曲线、细胞表型表达情况和碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性。2，．土=’。‘0k 徐州医学院硕士学位论文结果3组细胞均在接种后24h左右开始贴壁，并由圆形逐步变化为长梭形、多角形和不规则形等。3组细胞均随培养时间延长而增殖，生长曲线呈“S”形，PRP组与FBS组细胞生长迅速，明显快于无血清组(PO．05)。成骨诱导10天，A、C组糖原染色和I型胶原免疫细胞化学染色均呈阳性，B组细胞呈弱阳性，D组细胞呈阴性。成骨诱导14天，A、C组茜素红S染色阳性，可见染成红色的明显钙结节。结论自体PRP培养扩增的BMSCs，在体外成骨诱导培养下可定向分化为成骨细胞，并能够稳定表达成骨细胞的特异性表型。PRP能显著增强诱导剂诱导成骨的效能，但是PRP单独使用不能将BMSCs诱导为成骨细胞。、关键词骨髓间充质干细胞；富血小板血浆；组织工程；成骨分化4‘▲ 徐州医学院硕士学位论文Thestudyofproliferationandinducingosteoblastofrabbitbonemarrowmesenchymalstemcellsculturedbyautologousplatelet·-richplasma／nvitroAbstractBonemarrowmesenchymalstemcells(BMSCs)werecapableofmultipledirectionaldifferentiationpotentiality,andwerecommonlyusedseedcellsofbonetissueengineeringcurrently．StudyshowedthemoreamountoftransplantedBMSCs，thebetterclinicaltherapeuticeffect．ButlocalquantityofBMSCswasfew,whichneedcultureandproliferationinvitroinordertoensuregoodtherapeuticeffect．Heterogeneousserumwascommonlyusedculturemediumcurrently,suchasfetalbovineserum(FBS)andnew．borncalfserum(NBCS)，whichmightbringethiccontroversy,transmitingdiseasesandcausingimmunologicalantigenicityproblemsandSOon．Platelet—richplasma(PRP)wasextractionfromautologouswholeblood，canensuresecurityrelativelyandcontainkindsofgrowthfactors．ThisexperimenttriedtoculturerabbitBMSCswithautologousPRPinsteadofheterogeneousseruminvitro，toobserveeffectsofPRPonproliferationandosteoinductiondifferentiationinvitro，andtodiscussanewmethodofpromotingofproliferationanddifferentiationofBMSCs．Part1Effectofproliferationofrabbitbonemarrowmesenchymalstemcellsculturedinautologousplatelet·richplasma／nvitroobjevtiveCulturerabbitBMSCsinautologousPRPinvitro，toexploreinfluenceofPRPonbiologicalcharacteristicsofBMSCsproliferationinvitro．MethodsHaemospasiafromrabbit’Searcentralartery,thenpreparePRPbytwo．stagecentrifugation．Puncturedandsampledbonemarrowfromrabbit’Siliacbone，andcollectedBMSCsthroughthemethodofdensitygradientcentrifugation．BMSCsofeveryrabbitweredividedintoPRPgroup，FBSgroupandserum-freecontrolgroup，5‘一 徐州医学院硕士学位论文with6subjectsforeachgroup，andseparatelyculturedin10％autologousPRP,10％FBSandserum—free，combinedwithDMEM—F12，penicillinandstreptomycin．Toobservecellsmorphology,detectproliferatingactivityanddrawgrowthcurve，cellssurfaceantigenandalkalinephosphatase(ALP)activityofeachgroup．ResultsAfterinoculationofrabbitBMSCsforabout24hours，cellsof3groupsadheredtowall，presentedroundandchangedintofusiform，polygonalandirregularformsgradually．BMSCsof3groupsproliferatedwhenculturedtimeextended，andthegrowthcurveswere“S”shape，cellsproliferatedrapidlybothinPRPandFBSgroupscomparedwiththeserum—freecontrolgroup(P0．05)．GlycogenandcollagenIimmunocytochemicalstainingofgroupAandCwerebothpositivewheninducedosteoblastfor10days，groupBshowedweaklypositiveandgroupDWasnegativehomeochronouslywheninducedosteoblastfor10days．OnlygroupAandCwerepositive，whichcouldbeseenobviouslyredcalciumnodusbyAlizarinredSstainingwheninducedosteoblastfor14days．ConclusionBMSCsproliferatedbyautologousPRP,couldbeosteoinducedtoosteoblastandstablyexpresseosteoblasticphenotype／nvitro．PRPcouldsignificantlyamplifythesynergisticeffectofosteoinduction，butcouldnotosteoinducedBMSCstoosteoblasticbehavebyuseitalone．KeywordsBMSCs；PRP；tissueengineering；osteoinduction7 徐州医学院硕士学位论文，1￡-．j_．翮吾脊柱手术中常利用骨移植来促进脊柱融合和增强脊柱的稳定性【11，传统方法治疗骨缺损、骨不连也大都需要进行植骨处理。目前自体髂骨移植被广泛应用于临床，但30％左右患者有供区慢性疼痛、血肿、伤口感染和神经损伤等症状，而且增加术中失血及延长手术时间，并存在供移植的骨量不足、塑形困难等不利因素【21。异体骨移植存在诱发宿主产生免疫排斥反应和传播疾病(如HIV)的可能性【3训。因此，寻找具有良好生物学活性和强度的骨移植替代材料已成为研究的热点。组织工程技术的发展为研制骨移植替代材料提供了新的途径【51。骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)是骨髓中一种具有多向分化潜能的原始干细胞，体外可诱导分化为成骨细胞，将BMSCs与恰当的载体结合并应用于临床，可以获得与自体骨移植相似，甚至更好的疗效【61。BMSCs具有来源广泛、取材方便、容易扩增、易于外源基因的转染和表达等优势【7母】，并能分泌多种成骨活性因子，为爬行替代、骨折愈合创造有利条件，被认为是最好的骨组织工程种子细胞[101。‘目前对BMSCs的基础研究，取得了令人鼓舞的成果[11-13】。但在组织工程应用中受到诸多限制：第一，报道称移植的BMSCs数量越多，临床疗效越好[14-15】，而局部BMSCs的数量较少，一般都需要经过体外培养和扩增；其数量才能达到组织工程应用需求。第二，体外培养常以异种血清作为培养基，存在伦理学争议、传播疾病和潜在抗原性等问题[16-19】。所以BMSCs体外培养时若能使用自体血浆作为培养基，扩增得到高浓度的BMSCs，再应用于组织工程，既能提高治疗的效率，同时又可以避免因异种血清培养带来的伦理学争议和致病性等问题。富血小板血浆(platelet—richplasma，PRP)是来源于自体血的血液制品，可保证相对安全性，由全血经过离心、浓缩而得到，其特点是血小板浓度较高，且含有多种生长因子【20J。PRP中加入氯化钙(CaCl2)和凝血酶，使其释放出生长因子，R 徐州医学院硕士学位论文生长因子的含量与血小板的浓度呈正相关线形关系。PRP中主要的生长因子是血小板衍生生长因子(plateletderivedgrowthfactors，PDGFs)、类胰岛素生长因子(insulin．1ikegrowthfactors，IGFs)和转移生长因子一p(transforminggowthfactor-l}，TGF．D)等。自20世纪90年代开始，学者们对血小板中生长因子的生物学作用进行研究，发现其具有诱导骨再生的作用，特别是浓缩的富血小板‘2¨。PI冲中的血小板能够释放大量的生长因子，从而促进BMSCs的生长和增殖【22】。目前，PI心已应用于创伤骨科、颌面外科和牙周外科等领域。尽管动物实验和临床初步应用已证实PI廿有促进骨组织再生的作用；然而关于体外条件下，单独使用PI冲是否能够直接诱导细胞成骨分化的报道较少。所谓体外成骨，是指将经过纯化和扩增的BMSCs在一定的培养条件下，定向诱导分化为成骨细胞及骨细胞，在培养皿上形成类骨组织即骨结节。PRP在骨修复和重建中的作用已被证实，而PRP促进BMSCs向成骨细胞分化的研究，也已成为骨组织工程研究的热点。本实验通过使用PRP体外培养扩增BMSCs，再协同诱导因子诱导BMSCs成骨分化。在诱导BMSCs成骨分化时，设立实验对照组，仅仅使用PRP而不加入诱导因子，进行较长时间培养(大于14天)，即使细胞达到100％融合，也不予以传代，旨在研究单独使用PRP能否诱导BMSCs向成骨细胞分化。观察BMSCs在体外增殖、分化过程中细胞形态学的变化，MTT法检测细胞增殖活性并绘制生长曲线，流式细胞术检测细胞表面表型表达情况，检测细胞碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)、糖原和I型胶原表达的变化，以及钙结节形成情况。从而了解PI冲的生物学活性和诱导细胞成骨分化的时间，初步探讨PRP在骨组织工程应用中的意义，为进一步研究PRP在骨组织工程中的作用机理及应用价值提供实验依据，为PRP整体动物实验和临床应用提供理论依据。9tq，、■r●■r ～I▲徐州医学院硕士学位论文，第一部分自体富血小板血浆对兔骨髓间充质千细胞体外增殖的影响1材料1．1实验动物材料和方法健康日本长耳大白兔10只，雌雄不限，部由徐州医学院实验动物中心提供。1．2主要实验耗材10ml离心管25cm2培养瓶6、24、96孔培养板载玻片、盖玻片2001．tl、1000p1移液器枪头1．3主要试剂优质胎牛血清PBS缓冲液DMEM．F12培养基胰蛋白酶凝血酶淋巴细胞分离液滤膜碱性磷酸酶检测试剂盒10兔龄6～8个月，体重2．0"-'2．5公斤，全美国Coming公司徐州医学院设备科提供杭州四季青公司北京中杉金桥生物公司美国Gibco公司美国Sigma公司天津灏洋生物公司华美生物工程公司南京建成生物公司 徐州医学院硕士学位论文一FITC标记CD34、CD45、CD44和CD90抗体MTT试剂DMSO试剂Hoechst荧光染液1．4主要仪器YMT-Z型倒置显微镜LeicaDMR倒置荧光显微镜恒温C02培养箱’LDZ5．2型离心机数码照相机流式细胞仪HTS700型酶联免疫检测仪手提式压力蒸汽灭菌器79．1型磁力热搅拌器电热恒温水温箱普通冰箱细胞计数板微量移液器恒温振荡器外科手术基本器械美国eBioseience公司美国Sigma公司江苏碧云天公司日本Olympus公司德国Leica公司美国Forma公司北京医用离心机厂日本Sony公司美国BD公司日本东芝公司上海华线医用核子公司江苏江阴科研器械厂北京医疗设备厂青岛海尔公司上海求精生化试剂仪器公司法国Gilson公司江苏太仓实验设备厂华东医疗器械公司 徐州医学院硕士学位论文1．5主要试剂的配制1．5．1FIBS的分装胎牛血清置于56。C恒温水浴箱灭活30min，在无菌超净台中，将包装为100ml的FBS用血清瓶分装为20ml／瓶，．20℃保存备用。1．5．2DMEM．F12培养基的配制(1L)干粉型DMEM-F12培养基一包(15．69)，溶于约800ml的双蒸水中，再用双蒸水洗包装袋内面两次，倒入培养液中，以保证所有干粉都溶解成培养液。加入双抗(100U／ml青霉素和100斗g／ml链霉素)。磁力搅拌器搅拌2h(不能加热)，调节pH7．2～7．4，补加双蒸水到1000mI。微孔滤膜(0．221．tm)过滤除菌，无菌分装，-20*(2保存备用。抽样做无菌试验。1．5．3PBS缓冲液的配制(2L)将PBS缓冲液粉剂倒入大烧杯中，用双蒸水冲洗包装袋两次，并倒入烧杯中。用量筒加入2000ml双蒸水，将烧杯置于磁力搅拌器上搅拌(可加热)。微孔滤膜(O．221．tm)过滤除菌，无菌分装，4"C保存备用。1．5．4胰蛋白酶的配制(O．25％)称取胰酶0．259放入烧杯，加入新鲜配制的PBSl00ml，冰浴中低速搅拌0．5h，调节pH7．2～7．4，微孔滤膜(0．22pm)过滤除菌，无菌分装，一20。C保存备用。1．5．5MTT的配制用PBS溶解，配成终浓度59／L的溶液，．20。C避光保存备用。1．5．610％中性缓冲福尔马林的配制Na2HP04’12H：O6．59NaHEP044．0940％福尔马林100ml双蒸水至1000ml12 徐州医学院硕士学位论文2实验方法2．1兔自体PRP的制备从兔耳中央动脉抽血8．0ml(预先加入10％枸橼酸钠抗凝剂)，无菌条件下采用二次离心法制备PRP：第·次，室温下2400r／min离心10min，吸取上层血浆及血小板，转移到另一个无菌离心管内；第二次，室温下3600r／min离心15min，弃上层血浆，将剩余液体与激活剂(100U／ml凝血酶与lO％CaCl2的混合物)以9：l比例混合，振荡，4"C冰箱过夜，让血液凝固。血凝块充分收缩后1000r／min离心10min，吸取全部上清液，即为PRP，约O．5mL，微孔滤膜(O．22I-tm)过滤除菌，做好兔来源标记，．20"C保存备用。·2．2BMSCs的分离取6只日本长耳大白兔(雌雄不限)称重，耳缘静脉3％戊巴比妥钠(1ml／kg)麻醉。双侧髂后部剃毛，消毒，铺无菌巾。穿刺前先将穿刺针及注射器肝素化，用16号骨髓穿刺针在髂后上棘穿刺抽取骨髓约8ml，放入含有肝素(每lml骨髓加入1000U肝素抗凝)的无菌试管内，并加入等体积肝素化(1000U／m1)的PBS缓冲液，混匀后将细胞悬液缓慢注入到装有3ml淋巴细胞分离液的离心管内，利用密度梯度离心原理对骨髓悬液中干细胞进行分离(3000r／min，8min)，小心吸取交界处的白膜层(即单个核细胞层)，用PBS缓冲液洗涤两次(1500r／min，5min)。包扎兔穿刺伤口，术后肌注青霉素80万U／次，1次／天，3,--,5天。2．3BMSCs的培养将上述洗涤后的细胞分别接种于6个6孔板中并做好标记，每个板使用三个．孔，每个孔对应使用一种培养方法。PRP组采用培养基为干细胞来源个体的自体10％PRP配比DMEM，F12培养基；FBS组采用培养基为10％FBS配比DMEM-F12培养基；无血清组仅采用DMEM．F12培养基，各组培养基均含lOOU／ml青霉素和100“g／L链霉素。细胞放入37"C，5％C02饱和湿度恒温培养箱中，并标记为原代细胞(Po)。 徐州医学院硕士学位论文2．4BMSCs的换液准备好实验试剂和器材，包括细胞培养瓶、培养基、PBS液、离心管和吸管各若干，在无菌超净台中操作。按照分组情况对培养板上不同孔内的细胞更换相应的培养基。放入37℃，5％C02饱和湿度恒温培养箱中，做好时间标记。2．5BMSCs的传代准备好实验试剂和器材。将融合达90％的细胞中的培养基吸弃，加入少量胰酶，镜下观察细胞消化情况，及时中止消化，离心收集细胞(1500r／min，5min)。弃去离心后的上清，加入少量培养基，吹打沉淀以形成单细胞悬液。检测细胞活力后计数传代，按照原培养方法分别加入3种不同培养基。2．6BMSCs爬片方法24孔培养板中，每孔放入1张小玻片，将细胞用相应的培养基稀释为lxl04／ml，每孔lml接种于24孔培养板，待细胞贴壁后，吸出培养液，PBS冲洗，10％中性缓冲福尔马林固定，用中性树脂将小玻片粘于载玻片上，玻片晾干，用于HE染色、Hoechst荧光染色及免疫细胞化学染色等实验。3细胞观察和实验检测方法3．1BMSCs形态学观察原代及传代培养的细胞，用倒置显微镜逐日观察细胞的生长、增殖情况及形态学特征。取出传代培养时制备好的细胞爬片小玻片，分别做HE染色和Hoechst荧光染色，镜下观察并拍照。3．1．1HE染色方法苏木素浸染5min，自来水冲洗，以洗去苏木素和浮色，1％盐酸乙醇分化，使切片褪色至淡兰红色即可；流水洗涤3min；伊红液浸染2min；自来水冲洗，以洗去伊红浮液，并用纱布擦净玻片上的多余染料；50％，60％，70％，80％，90％，100％乙醇梯度脱水，每个梯度5min；二甲苯透明5minx2次；中性树脂封片，镜下观察并拍照。14 徐州医学院硕士学位论文3．1．2‘Hoechst荧光染色方法(1)制备染色液：将10ttgHoechst粉剂溶于lml双蒸水中；(2)细胞爬片上加少量染色液，覆盖细胞表面，室温放置3---5rain；(3)吸尽染色液，PBS洗片，5minx3次；(4)立即荧光显微镜下观察并拍照，实验及拍照过程注意避光。3．2BMSCs增殖测定(MTT法)并绘制生长曲线取生长状态良好的第3代细胞，胰酶消化成单细胞悬液，调整细胞浓度以每孔lxl04个细胞接种于96孔板，每组细胞接种48孔，置于37。C，5％C02饱和湿度培养箱培养，次日起每天选择6孔细胞，每孔加入MTT溶液20止，继续培养4h，终止培养，弃上清。每孑L：Jn150ttlDMSO，室温振荡10min使细胞成分裂解，并且使沉淀物充分融解。酶联免疫检测仪570nm波长处测定每孔光密度值(D570)，以培养时间为横坐标，D570值为纵坐标绘制生长曲线。3．3BMSCs细胞表型分析r取生长状态良好的第4代细胞，胰酶消化后收集细胞，每管lxl06个细胞，分别加入FITC标记的CD34、CD44、CD45和CD90抗体，常温暗室孵育半小时，PBS洗涤2次，流式细胞仪检测细胞CD34、CD44、CD45和CD90表达情况。3．4BMSCsALP活性测定分别收集3组第1～5代细胞，每代lxl05个细胞，离心弃上清，加入600lxl2％TritonX．100震荡30s，44C冰箱过夜裂解，储存于．20℃冰箱待检，共计90个样本。细胞ALP活性检测参照试剂说明进行(表1)。 峰l▲徐州医学院硕士学位论文表1BMSCsALP活性检测操作表测定管标准管空白管BMSCs细胞裂解液(m1)O．05O．1mg／ml酚标准液(m1)O．05双蒸水(m1)O．05缓冲液(m1)0．5O．50．5基质液(m1)O．50．5充分混匀37℃水浴15min显色剂(m1)1．5立即混匀，520nm波长，0．5cm光径比色，空白管调零，测每管光密度值(D520)ALP活性(U／100m1)计算公式=(测定管D520值／标准管D520值)×标准管含酚的量(O．005rag)×(100mI／0．05m1)4统计学处理用SPSSl6．0软件对数据进行统计学分析，计量资料采用抽表示，多个样本均数比较采用方差分析。P<0．05为差异有统计学意义。16 徐州医学院硕士学位论文lBMSCs形态学观察1．1BMSCs倒置显微镜观察结果3组原代细胞均在接种后24h左右开始呈半贴壁生长，48h后基本完全贴壁，呈扁平状(图la)。72h后细胞呈纺锤状，加入新鲜培养基后，细胞逐渐伸出伪足，变成多角形和梭形(图Ib)，可见PRP组和FBS组细胞生长迅速，明显快于无血清组。7天后逐渐形成集落，由数十个细胞融合而成，细胞按一定的方向排列，呈漩涡状，形如成纤维细胞(图le)。PRP组和FBS组原代细胞培养10天左右，细胞融合面积可达80～100％(图ld)，无血清组细胞需15天左右才能达到该融合状态，且有细胞脱片现象(图le)。当细胞融合达90％时予以传代扩增，此时细胞增殖旺盛，PRP组和FBS组细胞培养5---7天即可完全融合，铺满培养板的底面，细胞形态较为均一(图lf)。而无血清组细胞脱片较多，需7---9天才能传代。从每次传代所需时间看，PRP组细胞生长迅速，传代时间最短，细胞增殖明显快于FBS组和无血清组。1．2BMSCs染色观察第2代细胞传代培养时，制备细胞爬片，分别做HE染色(图2a、2b)和Hoechst荧光染色(图3a、3b)，镜下观察可见BMSCs核浆分明，其多角形、长梭形形态更加明显，细胞伪足也清晰可见。2BMSCs增殖情况测定3组细胞均随时间延长而增殖，PRP组与FBS组细胞O～2天为生长潜伏期，3---5天细胞生长活跃，呈指数级递增，为对数生长期，此后细胞增殖减缓进入平台期，生长曲线呈“S”形；无血清组细胞增殖缓慢，第4天起呈对数生长，至第7天达高峰，之后为平台期。从第3天起，PRP组与FBS组细胞生长迅速，明显快于无血清组(PO．05)，但均显著高于同代次FBS组和无血清组细胞ALP活性(尸O．05)(表3，图6)。18l2345678 ▲徐州医学院硕士学位论文表3第1代至第5代3组BMSC$ALP活性(露=6，夏虹，U／lOOml)ALP活性细胞代数PRP组FBS组无血清组14．27j=0．744．62．士0．894．36士1．1224．70-a：O．7635．65+0．9646．42+0．89+57．02+0．92’4．52士1．114．60-a：0．99‘4．94土：1．024．33士1．284．61士1．064．37士1．094．78士O．914．52士0．93与PRP组第l～2代相比：．尸<0．01；与FBS组及无血清同代次相比：．P0．05)(表4，图11)。表4第5代诱导培养4组BMSC$ALP活性测定结果(刀=6，商U／100mi)培养时间(天)ALP活性A组B组C组D组46810128．80士O．657．154-0．83#8．18+0．8411．16士O．867．80-a=0．88撑10．27=1=1．2814．08+1．188．224-0．84帮13．39+1．2017．314-1．318．684-1．11撑15．47士1．1718．13=t=1．158．80-J=0．94#16．96士1．204．93士0．64·△5．09士0．59簟△5．06士0．87·△5．39生O．7l·△5．33+0．77·△与A、B、C组同时间点相比：．P40mg／100m1)时，便可使类骨质钙化。(爹骨胶原纤维在胞外形成过程中作为结晶物，起着对骨盐沉积的诱导作用【461。研究表明BMSCs体外诱导成骨过程，主要经历了以下几个阶段：细胞转化期、细胞增殖期、细胞聚集分泌期、细胞外基质钙化期，在分化过程中可以观察到BMSCs逐渐转变成具有成骨细胞形态特征和生物活性的细胞，早期出现的ALP、糖原和I型胶原等，晚期出现钙结节。刍．．ALP是一种细胞内酶，是成骨细胞分化的标志物，其活性在细胞诱导早期即开始出现，是出现最早的成骨性标志，并且有时间依赖性，随着诱导时间延长而．增加，并与细胞的成骨分化成熟呈正相关，钙化期达高峰【471。因此可以作为判断成骨细胞功能状态的一个重要指标，用来衡量BMSCs向成骨细胞分化的程度。实验中测定细胞内ALP活性时发现，PRP诱导组和FBS诱导组细胞随着培养时间的延长，ALP活性从较低水平逐渐升高，12天后趋于稳定，这说明BMSCs经成骨诱导后向成骨细胞分化良好。I型胶原是构成骨基质的主要成分，它能通过蛋白激酶使靶蛋白磷酸化，增加细胞蛋白质的合成，另外可活化Na十／H十交换系统，促进成骨细胞的粘附、增殖和分化，并可促进新骨形成146，481。本实验通过免疫细胞化学方法检测细胞内I型胶原 徐州医学院硕士学位论文的表达情况，发现经成骨诱导lO天后，细胞I型胶原呈阳性表达。∥目前，BMSCs的鉴定是通过综合一系列的表型、形态结构和功能特性来完成[241。本实验采用二阳(CD44和CD90)和二阴(CD34和CD45)的BMSCs表面标记分子对体外培养的BMSCs进行检测，发现PRP组和FBS组第4代细胞CD44和CD90均呈阳性，表达在80％以上；CD34和CD45均呈阴，表达低于20％，说明BMSCs传至第4代时，细胞中仍有少量造血系统的干细胞。第4代BMSCs成骨诱导5天后，收集诱导的BMSCs流式细胞术检测，发现诱导细胞表面标记CD44和CD90均呈阳性，表达在96％以上；CD34和CD45均呈阴性，表达低于10％。说明本实验中BMSCs经过5天的诱导培养，其纯度进一步得到纯化，但成骨分化程度较低，仍然主要表达BMSCs的表型。本实验将细胞分为四组，采用10％体积分数的自体PRP、诱导因子的DMEM．F12，作为诱导培养实验组的培养基；以含10％体积分数FBS、诱导因子的DMEM—F12，作为诱导培养对照组的培养基；另外两组为对照组，分别单独使用PRP和FBS，配比DMEM．F12培养基培养。实验发现PRP诱导组及FBS诱导组细胞在形态学变化、ALP活性、细胞表型：表达、细胞I型胶原表达、糖原染色和茜素红S钙结节染色等各个方面的观察和检测中，均呈阳性变化，且PRP诱导组阳性变化最强；而单独PRP培养对照组及FBS培养对照组结果与前两组相反，表达为阴性或弱阳性变化。说明PRP能显著增强化学药物诱导成骨分化的效果。本实验中持续单独使用PRP培养细胞长达15天，没有观察到BMSCs向成骨细胞分化的形态学变化，指标检测中ALP活性较两诱导组明显偏低(P<0．01)，但比FBS对照组高，差异有统计学意义(尸．弓《△一《图5第4代PRP组BMSCs表型流式鉴定结果CD44和CD90表达均呈阳性，CD34和CD45表达均呈阴性1086420P1P2P3P4P5Passagetimes图6第1"---5代PRP组、FBS组和无血清组BMSCsALP活性与FBS组和无血清组相比：≯