富血小板血浆取代胎牛血清用于间充质干细胞的体外扩增

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1、富血小板血浆取代胎牛血清用于间充质干细胞的体外扩增　　间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一种未分化细胞，于发育早期的中胚层和外胚层，具有自我复制以及在一定条件下向骨、软骨、脂肪和肌肉等组织细胞分化的能力。因此，以MSCs为基础的细胞疗法得到广泛的研究，并且在临床上开展应用。在临床应用的准备阶段，MSCs需要在体外进行大量扩增。胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)能为细胞的增殖、迁移和分化等生物学行为提供营养、生长因子和激素等生物活性物质，是应用于细胞培养的最常见物质。然而，FBS含有的大量异种蛋白

2、，应用于临床可能引来一系列伦理和免疫风险，美国食品和药品管理局已经严格限制了FBS应用于临床。目前大量的研究在探索用富血小板血浆(platelet-richplasma，PRP)取代FBS用于MSCs的体外扩增。　　1PRP的生物学特性　　PRP是自体全血经离心后得到的血小板浓缩物，一般含有大量的血小板和少量的其他血细胞。血小板中含有丰富的生长因子，包括血小板源性生长因子(platelet-derivedgroable等发现，采用同一标准化流程制备和激活PRP，可避免由于静脉血采集自不同志愿者引起的个体差异，使其中的生长因子含量保持相对一致水平。

3、临床工作中，一般采用将多人份的血小板混合，制备成混杂PRP以减少批次间的差异，并由此获取大量的PRP。　　2PRP对干细胞体外增殖的作用　　与FBS相比，PRP可以显着促进骨髓间充质干细胞(bonemarroesenchymalstemcells，BMSCs)、脂肪间充质干细胞、肌肉干细胞、肌腱干细胞等的增殖，增加克隆形成率和纤维母细胞集落形成单位大小，减少达到汇合的时间。国内多位学者对PRP促进牙髓干细胞增殖的作用进行了研究。赵晟楠等用全自动血液细胞分析机采集人血小板并制备PRP，发现1%～20%PRP具有促进牙髓干细胞生长增殖的效应，其效果近

4、似10%FBS。唐凤勤等应用两步离心法制备PRP，研究结果显示10%PRP促进牙髓细胞增殖作用强于相同浓度的FBS，并且明显好于5%和20%的PRP。　　同时发现加入PRP后细胞形态发生明显的变化，由原来的长梭形，变为胞体减小、突起增加的极性细胞，将PRP去除后细胞又恢复原来的形态和生长速度。李威等研究了不同浓度的PRP对犬牙髓成纤维细胞的促增殖作用，认为随着PRP浓度的增加，对牙髓成纤维细胞的增殖作用经历下面3个阶段:①细胞的增殖与PRP的浓度呈正比;②PRP达到一定浓度，细胞的增殖反应呈饱和状态，细胞的增殖与PRP的浓度无关;③当PRP的浓度

5、继续升高，细胞的增殖与PRP的浓度呈负相关。即PRP对细胞增殖的作用为低浓度时刺激生长、高浓度时抑制生长的双向反应。段建民等的研究也支持PRP只在一定浓度范围内能够促进牙髓细胞的增殖，他们发现将PRP中的血浆去除后对牙髓细胞增殖的促进作用更强，提示可能血浆成分中存在对抗牙髓细胞增殖的因素。　　PRP的促增殖作用与其细胞成分密切相关。PDGF在促进细胞增殖方面可能起了关键的作用，用抗体选择性阻断PDGF后，PRP的促增殖作用被显着抑制。含有白细胞的PRP比不含白细胞的PRP释放碱性成纤维细胞生长因子的速度更快，促进BMSCs增殖的能力更强。脐带血的

6、PRP因含有更多的未分化细胞，其促增殖能力比静脉血的PRP更强。　　PRP的促增殖作用依赖于各种生长因子的协同作用。　　这些生长因子可以激活血小板源性生长因子受体/磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶/核因子κB信号通路，提高旁分泌水平，促进细胞再生，使细胞耐受不良环境的能力更强，减缓细胞的凋亡。　　Paarroesenchymalstemcell，BMMSCs)和脂肪间充质干细胞培养时优于或至少等效于FBS，对于PRP的最佳有效浓度没有一致的结论，归因于PRP制备方式的不同。　　将人的成骨细胞和自体PRP共培养，经流式细胞术检

7、测，成骨细胞的细胞周期没有发生改变，PRP的促进增殖作用随着时间的延长慢慢消失，因而不会引起细胞的无序增殖。Bieback等的研究显示，在BMSCs与PRP共培养的体系中未检测到自发性的细胞转化，在所有代数细胞中未检测到端粒酶活性。PRP促进细胞增殖的作用与细胞的状态有关，对不同年龄段志愿者的BMSCs进行培养发现，老年志愿者的细胞增殖能力显着降低。这些研究说明PRP不改变细胞的性状，不会导致细胞恶性变。　　3PRP维持干细胞干性的作用　　干细胞的干性，即干细胞保持自我更新和多向分化的能力，有赖于干细胞的不对称分裂。一个母代干细胞通过不对称分裂产

8、生一个子代干细胞和一个祖细胞，祖细胞再分化为终末细胞。干细胞在体外扩增时，一方面细胞群体数量要增加，更为重要的是要保持多向分化的能力。