医学论文-大鼠骨骺干细胞的分离鉴定及其永生化细胞株的构建

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1、医学论文-大鼠骨骺干细胞的分离鉴定及其永生化细胞株的构建【摘要】 分离、鉴定大鼠骨骺干细胞并建立永生化的大鼠骨骺干细胞株，为细胞移植和转基因治疗提供稳定的细胞来源。［方法］采用Percoll不连续密度梯度离心法分离骨骺干细胞，利用电穿孔转染技术将含有猿肾病毒40大T抗原基因(SV40Tag)的质粒pCMVSV40T／PUR转染骨骺干细胞，经嘌呤霉素筛选，抗性克隆扩大培养。应用FGFR-3抗体和PCNA抗体进行免疫细胞化学染色，观察细胞的形态及其生长状况并绘制细胞生长曲线。用免疫细胞化学法和RT-PCR检测SV40Tag在转染细胞中的表达。［结果］转染后获得一个阳性细胞克隆，免疫细

2、胞化学结果显示FGFR-3抗体染色阳性。SV40Tag抗体染色和RT-PCR结果显示SV40Tag已稳定转染入骨骺干细胞。转染细胞经扩大培养，命名为永生化骨骺干细胞。［结论］成功纯化大鼠骨骺干细胞并构建了SV40Tag永生化的骨骺干细胞株。【关键词】 骨骺干细胞永生化猿肾病毒40     Abstract：［Objective］Toseparateratprecartilaginousstemcells(PCSCs)andestablishimmortalizedprecartilaginousstemcell(IPCSC)strainwhichprovidesstablecel

3、lresourceforcell-transplantationandgenetherapies.［Method］PCSCswereisolatedbydiscontinuousPercollgradientcentrifugation.Thespecificmarker(anti-FGFR-3) of PCSCs was used to identify the cultured cells byimmunocytochemistry.PlasmidspCMVSV40T/PURcontainingthesimianvirus40largeTantigengene(SV40Tag

4、)weretransfectedintothePCSCsbyelectroporationmethod.Colonieswereisolatedbypuromycinselectionandamplifiedtocellstrain.TheexpressionofSV40TagintheamplifiedcellstrainwasidentifiedbyimmunocytochemistryandRT-PCR.Anti-FGFR-3andanti-PCNAwereusedtoidentifytheculturedcellsafterpuromycinselection.［Resu

5、lt］Oneanti-puromycincellclonewasobtained,whichwasconfirmedasFGFR-3positivePCSCswiththecapabilityofproliferation.ThemRNAandprotein expressionsofSV40Tagweredetectedintransfectedcellsafterstabletransfection.Thetransfectedcellswereamplifiedtoimmortalizedcellstrainmaintainedformorethan30passages,n

6、amedimmortalizedprecartilaginousstemcells(IPCSCs).Thepopulationdoublingtimeandanti-PCNApositiveconfirmedthehighcapabilityofproliferation.［Conclusion］Ratprecartilaginousstemcellswerepurifuedandimmortalizedprecartilaginousstemcellstrainwasestablishedsuccessfully.Itwillprovidestablecellresourcef

7、orthebasicresearchesandcell-transplantationtherapies.   Keywords：precartilaginousstemcells; immortalization; simianvirus40   骨骺干细胞(precartilaginousstemcells，PCSCs)是控制生长期动物肢体生长的、能定向分化的成体干细胞[1]，它作为组织工程的种子细胞，可用于软骨与骨缺损的细胞替代治疗[2]。由于PCSCs在第五代左右即开始分