大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与成骨鉴定

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1、大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与成骨鉴定：李显澎樊粤光刘建仁范海蛟江晓兵孙志刚曾建春阳建权【摘要】【目的】研究大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离纯化和在诱导条件下的成骨能力。【方法】取SPF级SD大鼠6只，采用全骨髓贴壁培养法分离成年大鼠骨髓间充质干细胞，取传至第3代的MSCs进行细胞形态和免疫组化鉴定；应用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的诱导分化培养液诱导传代细胞向成骨细胞分化，检测碱性磷酸酶（ALP）的活性和细胞矿化作用进行成骨细胞鉴定。【结果】全骨髓贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs，MSCs在含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM（L-DMEM）培养液中

2、生长性状相对稳定，增殖速度快；诱导条件下，细胞ALP活性明显增高，并出现了矿化结节。【结论】建立了一种体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓MSCs的方法，成骨能力肯定，为中药蛋白质组学研究提供材料基础。【关键词】骨髓间充质干细胞/病理学；细胞培养，体外的；组织工程　　骨髓间充质干细胞（MSCs）在体内外诱导因子的作用下，可向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、神经细胞和星形胶质细胞转化，具有很大的可塑性［1］，这使其在组织工程、细胞治疗等方面成为研究的热点［2］。为更好地将MSCs应用于骨质疏松症、骨坏死、骨缺损，本实验通过体外细胞培养的方法将MSCs从骨髓中分离纯化，观察MSC

3、s在体外的扩增、鉴定，并诱导其定向成骨分化。现报道如下。　　1材料与方法　　1.1动物SD大鼠6只，SPF级，体质量140~160g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号为：0025033。　　1.2主要试剂与仪器低糖DMEM（L-DMEM，美国Gibco公司，GNM31600）；兔抗大鼠CD34（BA0532）、CD44（BA0321）、CD54（BA0541）（武汉博士德公司）；高糖DMEM（Hyclone，SH30022.01B）；胎牛血清（Hyclone，SV30087.01）；胰蛋白酶（Hyclone，SV30042.01）；β-甘油磷酸钠（美国Simga公司）；

4、地塞米松（美国Sigma公司）；D-hanks（美国Simga公司）；维生素C（美国Sigma公司）；生物素化抗生蛋白链菌素复合物（streptavidinbiotinplex，SABC）（SA1022）试剂盒（武汉博士德公司）；二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）（AR1022）（武汉博士德公司）；其他试剂均为国产分析纯。C02恒温培养箱（SheldonManufactruing.Inc,modelNo:2323-2shellab，USA）；3k-15低温离心机（美国Sigma）；DL-CJ-IF超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司），MPS60倒置显微

5、镜（LeikaDMIRB）；超纯水系统（MILLPORE,SAS67120MOISHEMA,France）　　1.3培养液配制完全培养液：低糖DMEM（含体积分数为10％胎牛血清，10g/L青霉素、链霉素）；诱导分化培养液：高糖DMEM（含体积分数10％胎牛血清，10g/L青霉素、链霉素）中加入β-甘油磷酸钠、地塞米松、维生素C，终浓度分别为10mmol／L、10-8mol／L、50μmol/L。　　1.4骨髓间充质干细胞的分离［3-4］取健康成年SD大鼠（150g左右），1g/L新洁尔灭浸泡30min后，断颈处死，碘伏消毒，体积分数为75%的酒精消毒，铺无菌单盖住上身；无菌条件

6、下取双侧股骨、胫骨，除去骨表面附着的软组织，用L-DMEM浸泡清洗;用弯钳将两端骨骺切除，显露骨髓腔。用10mL注射器吸取L-DMEM培养液冲洗骨髓腔，以冲出骨髓；轻轻吹打，制成单细胞悬液；1000r/min离心20min，离心后去上清，用完全培养液重悬，入培养瓶中，用完全培养液培养。　　1.5骨髓基质干细胞的原代和传代培养将上述所得细胞悬液接种于25mL塑料培养瓶中，置37℃、体积分数5%CO2饱和湿度条件下培养。于培养后的第3天更换培养液以更新细胞代谢环境。以后每3d换液1次，去除未贴壁的细胞，待细胞汇合约80％时，用2.5g/L胰蛋白酶+0.4g/L乙二胺四乙酸（EDTA）

7、消化，按1：2传代培养。　　1.6大鼠骨髓MSCs的生长曲线测定取生长良好的第2、3代细胞（P2、P3），2.5g/L胰蛋白酶消化，1×104／mL接种于24孔板，每天各取3孔消化计数，每孔计数3次，连续7d。以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，描绘生长曲线（图1）。　　图1大鼠骨髓MSCs生长曲线（略）　　Figure1Groin；磷酸盐缓冲液（PBS）洗2min，共3次；滴加正常山羊血清，室温10min，除去多余液体，滴加多克隆兔抗大鼠CD34、CD44、CD54，4℃过夜；