大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与成骨鉴定

大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与成骨鉴定

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1、大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与成骨鉴定:李显澎樊粤光刘建仁范海蛟江晓兵孙志刚曾建春阳建权【摘要】【目的】研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离纯化和在诱导条件下的成骨能力。【方法】取SPF级SD大鼠6只,采用全骨髓贴壁培养法分离成年大鼠骨髓间充质干细胞,取传至第3代的MSCs进行细胞形态和免疫组化鉴定;应用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的诱导分化培养液诱导传代细胞向成骨细胞分化,检测碱性磷酸酶(ALP)的活性和细胞矿化作用进行成骨细胞鉴定。【结果】全骨髓贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs,MSCs在含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM(L-DMEM)培养液中

2、生长性状相对稳定,增殖速度快;诱导条件下,细胞ALP活性明显增高,并出现了矿化结节。【结论】建立了一种体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓MSCs的方法,成骨能力肯定,为中药蛋白质组学研究提供材料基础。【关键词】骨髓间充质干细胞/病理学;细胞培养,体外的;组织工程  骨髓间充质干细胞(MSCs)在体内外诱导因子的作用下,可向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、神经细胞和星形胶质细胞转化,具有很大的可塑性[1],这使其在组织工程、细胞治疗等方面成为研究的热点[2]。为更好地将MSCs应用于骨质疏松症、骨坏死、骨缺损,本实验通过体外细胞培养的方法将MSCs从骨髓中分离纯化,观察MSC

3、s在体外的扩增、鉴定,并诱导其定向成骨分化。现报道如下。  1材料与方法  1.1动物SD大鼠6只,SPF级,体质量140~160g,由广州中医药大学实验动物中心提供,合格证号为:0025033。  1.2主要试剂与仪器低糖DMEM(L-DMEM,美国Gibco公司,GNM31600);兔抗大鼠CD34(BA0532)、CD44(BA0321)、CD54(BA0541)(武汉博士德公司);高糖DMEM(Hyclone,SH30022.01B);胎牛血清(Hyclone,SV30087.01);胰蛋白酶(Hyclone,SV30042.01);β-甘油磷酸钠(美国Simga公司);

4、地塞米松(美国Sigma公司);D-hanks(美国Simga公司);维生素C(美国Sigma公司);生物素化抗生蛋白链菌素复合物(streptavidinbiotinplex,SABC)(SA1022)试剂盒(武汉博士德公司);二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)(AR1022)(武汉博士德公司);其他试剂均为国产分析纯。C02恒温培养箱(SheldonManufactruing.Inc,modelNo:2323-2shellab,USA);3k-15低温离心机(美国Sigma);DL-CJ-IF超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司),MPS60倒置显微

5、镜(LeikaDMIRB);超纯水系统(MILLPORE,SAS67120MOISHEMA,France)  1.3培养液配制完全培养液:低糖DMEM(含体积分数为10%胎牛血清,10g/L青霉素、链霉素);诱导分化培养液:高糖DMEM(含体积分数10%胎牛血清,10g/L青霉素、链霉素)中加入β-甘油磷酸钠、地塞米松、维生素C,终浓度分别为10mmol/L、10-8mol/L、50μmol/L。  1.4骨髓间充质干细胞的分离[3-4]取健康成年SD大鼠(150g左右),1g/L新洁尔灭浸泡30min后,断颈处死,碘伏消毒,体积分数为75%的酒精消毒,铺无菌单盖住上身;无菌条件

6、下取双侧股骨、胫骨,除去骨表面附着的软组织,用L-DMEM浸泡清洗;用弯钳将两端骨骺切除,显露骨髓腔。用10mL注射器吸取L-DMEM培养液冲洗骨髓腔,以冲出骨髓;轻轻吹打,制成单细胞悬液;1000r/min离心20min,离心后去上清,用完全培养液重悬,入培养瓶中,用完全培养液培养。  1.5骨髓基质干细胞的原代和传代培养将上述所得细胞悬液接种于25mL塑料培养瓶中,置37℃、体积分数5%CO2饱和湿度条件下培养。于培养后的第3天更换培养液以更新细胞代谢环境。以后每3d换液1次,去除未贴壁的细胞,待细胞汇合约80%时,用2.5g/L胰蛋白酶+0.4g/L乙二胺四乙酸(EDTA)

7、消化,按1:2传代培养。  1.6大鼠骨髓MSCs的生长曲线测定取生长良好的第2、3代细胞(P2、P3),2.5g/L胰蛋白酶消化,1×104/mL接种于24孔板,每天各取3孔消化计数,每孔计数3次,连续7d。以培养时间为横坐标,细胞数为纵坐标,描绘生长曲线(图1)。  图1大鼠骨髓MSCs生长曲线(略)  Figure1Groin;磷酸盐缓冲液(PBS)洗2min,共3次;滴加正常山羊血清,室温10min,除去多余液体,滴加多克隆兔抗大鼠CD34、CD44、CD54,4℃过夜;

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