大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与成骨鉴定论文

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1、大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与成骨鉴定论文李显澎樊粤光刘建仁范海蛟江晓兵孙志刚曾建春阳建权【摘要】【目的】研究大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离纯化和在诱导条件下的成骨能力。【方法】取SPF级SD大鼠6只，采用全骨髓贴壁培养法分离成年大鼠骨髓间充质干细胞，取传至第3代的MSCs进行细胞形态和免疫组化鉴定；应用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的诱导分化培养液诱导传代细胞向成骨细胞分化，检测碱性磷酸酶（ALP）的活性和细胞矿化作用进行成骨细胞鉴定。【结果】全骨髓贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs，MSCs在含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM（L-DMEM）培养液中

2、生长性状相对稳定，增殖速度快；诱导条件下，细胞ALP活性明显增高，并出现了矿化结节。【结论】建立了一种体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓MSCs的方法.freelga公司）；地塞米松（美国Sigma公司）；D-hanks（美国Simga公司）；维生素C（美国Sigma公司）；生物素化抗生蛋白链菌素复合物（streptavidinbiotinplex，SABC）（SA1022）试剂盒（武汉博士德公司）；二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）（AR1022）（武汉博士德公司）；其他试剂均为国产分析纯。C02恒温培养箱（SheldonManufactruing.Inc,mo

3、delNo:2323-2shellab，USA）；3k-15低温离心机（美国Sigma）；DL-CJ-IF超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司），MPS60倒置显微镜（LeikaDMIRB）；超纯水系统（MILLPORE,SAS67120MOISHEMA,France）1.3培养液配制完全培养液：低糖DMEM（含体积分数为10％胎牛血清，10g/L青霉素、链霉素）；诱导分化培养液：高糖DMEM（含体积分数10％胎牛血清，10g/L青霉素、链霉素）中加入β-甘油磷酸钠、地塞米松、维生素C，终浓度分别为10mmol／L、10-8mol／L、50μmol/L。1.4骨髓间充质干细胞的

4、分离［3-4］取健康成年SD大鼠（150g左右），1g/L新洁尔灭浸泡30min后，断颈处死，碘伏消毒，体积分数为75%的酒精消毒，铺无菌单盖住上身；无菌条件下取双侧股骨、胫骨，除去骨表面附着的软组织，用L-DMEM浸泡清洗;用弯钳将两端骨骺切除，显露骨髓腔。用10mL注射器吸取L-DMEM培养液冲洗骨髓腔，以冲出骨髓；轻轻吹打，制成单细胞悬液；1000r/min离心20min，离心后去上清，用完全培养液重悬，入培养瓶中，用完全培养液培养。1.5骨髓基质干细胞的原代和传代培养将上述所得细胞悬液接种于25mL塑料培养瓶中，置37℃、体积分数5%CO2饱和湿度条件下培养。于培养后的第3

5、天更换培养液以更新细胞代谢环境。以后每3d换液1次，去除未贴壁的细胞，待细胞汇合约80％时，用2.5g/L胰蛋白酶+0.4g/L乙二胺四乙酸（EDTA）消化，按1：2传代培养。1.6大鼠骨髓MSCs的生长曲线测定取生长良好的第2、3代细胞（P2、P3），2.5g/L胰蛋白酶消化，1×104／mL接种于24孔板，每天各取3孔消化计数，每孔计数3次，连续7d。以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，描绘生长曲线（图1）。图1大鼠骨髓MSCs生长曲线（略）Figure1Groin；磷酸盐缓冲液（PBS）洗2min，共3次；滴加正常山羊血清，室温10min，除去多余液体，滴加多克隆兔抗大鼠CD

6、34、CD44、CD54，4℃过夜；0.01mol/LPBS洗5min，共3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃作用20min，0.01mol/LPBS洗5min共3次；滴加SABC，37℃作用20min，0.01mol/LPBS洗5min，共4次；DAB显色，取1mL双蒸水，加试剂盒A、B、C试剂各1滴，混和后加到切片，室温显色，镜下控制反应时间。双蒸水洗涤，苏木素复染2min，时间按所需要的着色强度而定，双蒸水洗涤3次，每次2min；放入烘箱40℃烘干脱水，用树胶封片，干燥后观察。1.8骨髓间充质干细胞的诱导分化［6］培养第5代MSCs以1×105个／mL的密度接种于6孔培养

7、板（内铺有预处理的盖玻片），加完全培养液，48h后观察细胞融合80%后，吸去完全培养液。实验组加入诱导分化培养液，对照组加入等量完全培养液，每3d换液1次。1.9成骨细胞鉴定［7］1.9.1钙钴法测定碱性磷酸酶（ALP）活性将细胞接种于预先放有盖玻片的6孔板内，于第5天时吸取出培养液，用PBS冲洗3次，每次1min；中性福尔马林室温固定10min后蒸馏水冲洗3次；加入新鲜的孵育液37℃孵育6h，蒸馏水冲洗3次；20g/L硝酸钴水（现配现用）溶液浸泡5min，蒸馏水冲洗