干扰载体构建SOP

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1、shRNA干扰载体构建SOP目录第一部分RNA干扰原理及shRNA设计4第二部分酶切与回收7第三部分退火与连接9第四部分转化与涂平板11第五部分挑菌与菌液PCR13第六部分质粒提取15第一部分RNA干扰原理及shRNA设计标准操作规程(SOP)1.目的：了解RNA干扰原理，设计shRNA干扰序列2.仪器与设备：需要能够连接Internet的个人计算机，引物设计相关软件(如PrimerPremier5)。3.操作步骤3.1RNA干扰原理1)RNAi概述：RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由

2、双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing)。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用

3、到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。2)RNAi原理：RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititationandeffectorsteps)。在起始阶段，小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(smallinterferingRNAs,siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因,病毒感染等各种方式引入的双链RNA，形成19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片

4、段的3’端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录体上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。3)RNAi示意图(见图1)3.2shRNA设计1)shRNA:即shorthairpinRN

5、A(短发卡RNA)，包含两个短反向重复序列(其中一个与目的基因互补)，中间由一个loop序列分隔，组成发夹结构。shRNA在体内可以被加工成siRNA从而降解目的基因.。示意图见图2。1)shRNA作用原理：见图3。2)shRNA设计原则：l克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子；l两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点；lStrataGENE发现29个寡核苷酸较之原先推荐的23个寡核苷

6、酸可以更有效的抑制目的基因；l在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生；lshRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。如果选择的目的序列不以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G；lShRNA插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的茎环都被成功的运用过。其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有shRNA插入片段的克隆。在比较了众多不同长度和序列的茎环，5'TCAAGAG3'序列最为有效(AMBIONuse)；l5-6个T必须放置在shRNA

7、插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录(stop)；l在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T，这可能导致shRNA转录的提前终止；l从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找“AA或者NA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。正义链和反义链都采用这19个碱基(不包括AA或者NA重复)来设计。图1RNAi原理图2shRNA示意图图3shRNA作用原理1)shRNA设计举例l以人源基因VEGFC为例，选取干扰靶点序列为：GCCGATGCATGTCTAAACTl在该序列两端加上酶切位点，

8、中间插入Loop环，设计shRNA片段：BamHI靶点序列环结构靶点反义序列HindIIIGATCCGCCGATGCATGTCTAAACTTTCAAGAGAAGTTTAGACATGCATCGGCTTTTTTAGCGGCT