瘢痕疙瘩cdc2l1、runx3和camta1基因突变的研究

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2、库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复饲手段保存、，【编学位论文，可以公布(包括刊登)论文的全部或部分内容．导师享有发表学位论文、申请成果和专利的权利．注；保密的学位论文在解密后适用本声明．作者签名：导师签名：日期：瘢痕疙瘩RUNX、CAMTAl和CDC2L1基因突变的研究摘要【目的】瘢痕疙瘩(keloid)是整形外科基础研究的重要课题，其根本形成机制迄今尚未查明，寻找瘢痕疙瘩的相关调控基因已成为当前瘢痕研究的热点之一．本课题组在前期研究中成功应用比较基因组杂交技术(CGH)成功构建病理性瘢痕

3、染色体变异频率图谱，证实在l号染色体短臂术端存在DNA拷贝数的高频率缺失，并通过微卫星多态分析发现在1p36区域存在基因杂合性缺失(LOH)，提示该区域可能存在相关瘢痕抑制基因。单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphisms，SNP)是同一物种不同个体问染色体上遗传密码单个碱基的变化。主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入或缺失等。SNP是继RFLP、SSR之后的第三代分子标记。尽管原则上有4种核苷酸，但SNP

4、通常具双等位基因多念性，其突变率相当低，是一种稳定的突变，比之前的分子标记更为有用．变性高效液相色谱分析技术(denaturinghigllperformanceliquidchromatography,DHPLC)是一种高通量筛选基因组DNA序列变异的新方法，在遗传做图和定位克隆致病基因，基因突变分析等领域得到广泛的应用．DNA测序(DNAsequencing)技术是一种最为精确的分子诊断技术，在遗传性疾病和肿瘤的诊断领域内占有重要地位，目前主要应用于鉴定基因，检测突变，分析噬菌体文库等方面。

5、这两种方法巳分别被广泛应用于肿瘤基因检测，但是，两者结合应用于瘢痕疙瘩目前国内外尚未见报道。本课题采用变性高效液相色谱分析技术力[IDNA测序技术，对DNA拷贝数高频率缺失的lp36区域的目前研究热点基因片段RUNX3、CAMTAl和CDC2LI进行筛查，检测瘢痕疙瘩相关基因突变情况，寻找可能存在的瘢痕疙瘩抑制基因并精确定位其在染色体上的位置，以期从基因水平阐明瘢痕疙瘩的发病机制，为临床上进行有效的治疗和预防奠定基础。【方法】收集13例患者瘢痕疙瘩组织和血液标本，分别抽提出相应基因组DNA，在经

6、瘢痕疙瘩染色体变异频率图谱和微卫星多态分析证实的DNA拷贝数高频率缺失的l号染色体短臂末端区域，采用目前国外研究报道较多RUNX3基因RHl20480、C舢朋’Al基因G65551、SHGC．149152以及CDC2Ll基因EXON7和ExONll片段进行PCR扩增。回收纯化后进行基因组变性高效液相色谱分析加DNA测序分析，将瘢痕组织的DNA序列分别与血液和Genebank的对应序列进行比较、分析所检测基因片段SNP位点．【结果】研究显示，所选取的五条基因片段，在血液标本中均未发现突变，而瘢痕疙

7、瘩组织的相关碱基序列经分析发现有多个SNP位点，而且是多位点、多类型的．具体变化情况如下：(1)本研究所选取的5个基因片段RUNX3基因G56267，CAMTAI基因G65551、SHGC．149152、CDC2LI基因EXON7和EXoNll，经PCR扩增后将PCR反应液送Transgenomic公司歼发的WAVEDHPLC系统检测DNA，DHPLC筛查结果显示在扩增片段中出现杂合峰与纯合峰两种情况，血液样品均为单个色谱峰显示为纯合链；瘢痕疙瘩组织样品为双峰则表示是杂合异源双链。出现杂合峰显示

8、有突变的异源双链存在．(2)RUNX3基因RHl20480；根据DHPLC筛查结果，选取具有代表性的杂合子和纯合子样本进行基因序列分析发现13例患者的瘢痕组织DNA样本中，有12例发现突变，突变率为92-3％．发现2个SNP位点，其中ll例患者的第96位碱基A的缺失、12例患者的第279位碱基的C的插入突变。瘢痕疙瘩组织中RUNX3基因RHl20480片断的突变呈多念性，为多位点、多类型基因突。(3)CAMTAI基因G65551：根据DHPLC筛查结果，选取具有代表性的杂合子和纯合子样本进行基因