瘢痕疙瘩基因诊断的实验研究

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1、第一军医大学硕士学位论文瘢痕疙瘩基因诊断的实验研究姓名：靳睿申请学位级别：硕士专业：整形外科学指导教师：高建华20030501PaSFasLFasRFasMcabFDDMPCRSSCPRFLPPCR．RFLPSDSPKEp管RNascEBRpmPAGE中英文对照factorassociatedsuicide自杀相关因子FasligandFas配体FasreceptorFas受体FasmonocloneantibodyFas单克隆抗体FasDeathDomainFas死亡域mutiplepolymerase

2、reaction多重聚合酶链反应single-strandcomformation单链构象多态性polymorphismRestrictionFragmentLength限制性酶切片段Polymorphism长度多态性分析PCR产物限制性酶切片段长度多态性分析proteinaseKribomucleicacidkinaseEthidiumrevolutionsperminute十二烷基硫酸钠蛋白酶KEppendorf管RNA酶溴化乙锭每分钟转速非变性聚丙烯酰胺电泳摘要背景：Fas蛋白被认为是细胞凋亡过程中

3、最重要的调控因子之一，我们前阶段的研究发现，瘢痕疙瘩组织中Fas基因外显子6、8、9存在突变，而这些突变可能是成纤维细胞凋亡缺陷的主要原因之一，从而导致了瘢痕疙瘩的发生。目的：本课题拟建立多重PCR--SSCP反应体系，以达到简便、快速筛选瘢痕疙瘩Fas基因突变的目的，为进一步研究该基因在瘢痕疙瘩组织中的突变情况，以及临床上瘢痕疙瘩的基因诊断、手术预测提供实验基础。方法：1，本研究拟采用mPCR-SSCP方法。在深入分析了人Fas基因外显子6、8、9的序列后，按照多重PCR引物设计原则，设计了三对相应引物

4、；2．先分别找出各外显子的最佳扩增条件，再进行综合分析，最终得到一个理想的多重PCR扩增条件，以此条件扩增出正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中的目的基因；3．将所得多重PCR反应产物在单基因对照下进行银染mSSCP分析，进而筛选基因突变。4．将扩增序列进行测序并与GeaBank中标准序列进行对比以确定突变。结果：1。各外显子单一扩增片段和多重PCR扩增条带均清晰，产量较高，无非特异性扩增，产物长度与理论值一致；DNA测序证实，各扩增产物即各外显子基因片段：2．经银染mSSCP分析，在正常皮肤组织和增生性

5、瘢痕中均未检出突变，在23例瘢痕疙瘩标本中，出现异常电泳带的有18例：3．经测序并分析突变，在单一外显子电泳中，最高阳性率为52％，在两个外显子同时电泳中，最高阳性率为74％，而三个外显子同时电泳则可达到78％的检出率，说明mPCR-SSCP可提高突变检出率，同时本研究中发现了新的突变。结论：1．本实验成功建立了用以分析瘢痕疙瘩Fas基因突变的mPCR--SSCP方法，实现了对Fas基因中常见突变的三个外显子多重PCR扩增，并以mSSCP方法快速筛选分析突变，与以往传统方法相比，实现了一次同时扩增分析三个

6、外显子，为瘢痕疙瘩基因诊断和进一步相关的分子生物学研究提供了一个经济、快捷的方法，对于瘢痕疙瘩Fas基因的突变研究具有较高的应用价值；2．经本研究方法分析证明：瘢痕疙瘩组织中Fas基因的突变导致了成纤维细胞的凋亡缺陷，Fas基因外显子8和9的突变在这一病理过程中可能具有重要意义，可能与该病的发生有密切关系；3．5例瘢痕疙瘩组织中未检测出突变，提示瘢痕疙瘩的形成与多个基因的突变相关。【关键词】瘢痕疙瘩；Fas基因：基因突变；基因诊断；多重PCR；mPCR——SSCPAbstractBackground：Fa

7、swasconfirmedtobeoneofthemostimportantfactorsintheprocessofapoptosis．Ourpreviousstudieshavetestifiedthereweresomemutationsintheexon6，8，9inFasgenewhichwasthoughttobecloselyrelativetothedefectinfibmblastsapoptosis．objeetive：Toestablishaconvenientandfastdete

8、ctionofmutationsmPCR—SSCPwasperformedtoinvestigatethemutationsituationsofexon6，8，9ofFasgeneandthensettheexperimentalfundationforthefutureciinicalgenediagnosisandthepredictionofoperationinkeloidspatients．Methods：1．mP