大鼠肝移植急性排斥反应的淋巴细胞蛋白质组学研究论文

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1、博士学位论文大鼠肝移植急性排斥反应的淋巴细胞蛋白质组学研究博士研究生：张国伟指导老师：周杰教授摘要目前，原位肝移植是目前治疗包括肝硬化、酒精肝及原发性肝癌等终末期肝病最有效的方法。虽然不断提高的外科技术大大提高了移植的成功率，但移植排斥反应仍然是目前临床面临的一个主要问题，特别是手术结束后短期内排斥反应发生的可能性仍然很大。新型免疫抑制剂可有效抑制急性排斥反应，但不能从根本上避免急性性排斥反应的发生。而且，长时间应用免疫抑制剂，存在产生感染、肿瘤等并发症的潜在风险。因此，有效解决排斥反应尤其是急性排斥反应对临

2、床肝脏移植所带来的束缚，成为移植学家和免疫学家共同所追求的目标。排斥反应是一种复杂的免疫学现象，深入研究其机制有利于提高临床器官移植的成功率。近年来蛋白质组学理论和技术获得了迅速发展，为我们从系统的角度来解析排斥反应等移植问题的复杂机制提供了可能。双向电泳(TwoDimensionalE1ectrophoresis，2DE)和蛋白质组信息学是蛋白质组研究的关键核心技术。由于双向电泳技术在蛋白质组与医学研究中所处的重要位置，它可用于蛋白质转录及转录后修饰、蛋白质组的比较、蛋白质问的相互作用、细胞分化凋亡、致病机

3、制及耐药机制、疗效监测、新药开发、癌症研究、蛋白纯度检查、小量蛋白纯化以及研究替代疫苗等许多方面。近几年，蛋白质组学与代谢组学逐渐被应用到器官移植的同种异体排斥反应以及发现排斥反应相关生中文摘要物标记物等领域；利用双向电泳与质谱技术，Pan等分析了大鼠原位肝移植自发性免疫耐受现象并发现了与之相关的一些生物标记物。Clarke等将尿液蛋白质组学研究应用于肾移植领域，并把它发展为一种急性肾移植排斥的诊断方法，显示出这一技术应用于器官移植领域的有效前景。在免疫排斥反应当中，淋巴系统尤其是T细胞的免疫行为调控机制目前

4、不明确。本实验运用双向凝胶电泳并结合质谱技术对大鼠肝移植术后急性排斥反应模型的淋巴细胞进行研究，筛选、分析发生表达变化的蛋白质，以期了解与排斥反应相关的特异性蛋白质及它们之间的相互关系，从蛋白质水平揭示淋巴细胞在肝移植术后急性排斥反应中的分子机制。基于上述考虑，首先建立大鼠异种基因肝移植的急性排斥动物模型，分离出模型大鼠脾脏的淋巴细胞，利用差异蛋白质组学鉴定急性排斥反应的相关功能蛋白，拟对肝移植急性排斥反应的分子机制从蛋白质水平进行系统研究。本部分研究的具体内容总结如下：第一部分：改良Kamada法大鼠原位肝

5、移植模型的建立方法：利用改良Kamada法建立稳定的大鼠原位肝移植动物模型，模型的建立是本项研究的基础。我们采用该方法对113只大鼠进行预试验练习，通过总结失败原因，试验组的110只大鼠手术成功率和1周存活率(90．9％)明显提高。结果：所有数据分析采用SPSSl7．0软件完成，利用x2检验比较两组术后1周生存率有显著性差异。试验组肝上下腔静脉的吻合时间为10～15分钟，无肝期为18---20分钟。术后常见的并发症为腹腔出血、肝下下腔静脉狭窄血栓形成、左膈下静脉出血、胆管梗阻、门静脉狭窄血栓形成、感染、麻醉过

6、深以及呼吸衰竭。小结：大鼠肝移植模型是一种难度较大的手术，术中供肝的游离、灌注、冷保存，套管，受体肝脏的游离、切除、供肝置入受体后血管的吻合以及大鼠活力、解剖结构和变异等各个环节都会影响大鼠肝移植术后的存活率。我们不仅需要形成标准化的手术操作流程，而且需要术中仔细、轻柔的操作和熟练的显微外科技术。归纳起来，我们将大鼠肝移植模型制作预防并发症的经验总结Ⅱ博士学位论文如下：(1)重视早期动物模型的预试验操作，细致熟练的显微外科技术是预防术中、术后并发症的先决条件；(2)麻醉的深浅控制是手术成功的保障；(3)尽量缩

7、短受体无肝期是决定术后生存率的关键；(4)改善术后饲养环境及合理的抗菌素应用是预防术后感染的必要手段。第二部分：移植肝血清IL_2与IFN_Y水平检测及组织切片分析方法：在前期动物模型制作的基础上，选取10周龄Wistar大鼠6只，10周龄SD大鼠18只，体重250～3009。实验动物清洁饲养，术前禁食12h，自由饮水。Wistar大鼠作为异基因移植组供体，SD大鼠作为同基因移植组供、受体与异基因移植组受体。将6只Wistar大鼠和18只SD大鼠分成两组。第一组：急性排斥反应组(从Wistar大鼠移植到SD大

8、鼠，6对)；第二组：同基因移植对照组(从SD大鼠移植到SD大鼠，6对)。手术采用吸入乙醚麻醉，大鼠肝移植模型采用改良Kamada“双袖套法"，不吻合肝动脉。手术均在无菌条件下进行。抽取同基因移植对照组与急性排斥组肝移植后SD大鼠血清样本。血清IL-2与IFN—Y水平分别用大鼠IL一2与IFN—YELISA试剂盒测定。移植后的肝组织用10％福尔马林，4"C固定过夜，石蜡包埋，切片厚度为4um，经HE染