联合基因（cd和tnfα）治疗喉癌的实验研究

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1、中山大学硕士论文(2008)联台基冈(CD和TNF．a)治疗喉癌的实验研究联合基因(CD和TN卜程)治疗喉癌的实验研究研究背景和目的：专业：耳鼻咽喉科学硕士研究生：粱伟英导师：柴丽萍主任医师中由大学附属第一医院耳鼻咽喉科医院中文摘要喉癌是最常见的头颈恶性肿瘤之～，全球每年约有190，000例新增喉癌病例，并且其发病率有增高趋势。晚期喉癌经手术或术后辅以放疗或化疗的5年生存率不足60％，术后造成喉功能全部或部分丧失，生活质量明显下降，严重的威胁着人类的生命和健康。基因治疗是治疗恶性肿瘤的最具有潜力的新方法，由手瓣瘤酶发生、发展及转移是

2、多因素及多阶段的复杂过程，联合基因治疗可从多个环节控制肿瘤的发生及发展，提高基因治疗的肿瘤抑制率和抗肿瘤免疫效应，降低其毒副作用。目前国内外学者进行的有关联合基因抑制肿瘤的实验，均存在联合基因构建操作复杂，容易突变，肿瘤抑制效果不理想，选择的基因治疗窗小等不足，同时未见有胞嘧啶脱氨酶(cytosinedeaminase，CD)基因联合牌瘤坏死因子一壤(toumornecrosisfactor一旺，TNF—CI)基因治疗喉癌的实验研究。自杀基因前体药物系统CD／5．氟胞嘧啶(5一fluorocytosine，5-FC)将无毒性前药5一

3、Fc转化为细胞毒产物5．氟尿嘧啶(5一fluorouracil，5一FU)，从而阻止DNA合成，使靶细胞走向死亡。TNF-Q能充分调动机体的抗肿瘤兔疫反应，对肿瘤有直接杀伤作用，损伤肿瘤组织微瞧管。两释基因的肿瘤抑制机制不同，露且有协同作用，因而可以从多个环节抑制肿瘤生长，达到优势互补，提高肿瘤抑制率及抗肿瘤中山大学硕士论文(2008)联合基因(CD和TNF．a)治疗喉癌的实验研究免疫反应的目的。质粒载体pcDNA3。l(+)跟常用的病毒载体比较，具有无免疫原性、安全、能稳定遗传等特点。另外peDNA3．1(+)中CMV启动予来源于

4、巨细胞病毒，是可以启动井源性基因表达的强启动予；并盛本研究所插入的目的基因CD和TNF-往片段小，仅有1284bp和687bp，操作简单。本研究通过构建自杀基因CD联合细胞因子TNF—Q基因共表达的非病毒载体并导入喉癌Hep一2细胞，观察eD基因和l鹣F-Q基因共表达产物在5一雕作用下于体内外对喉癌细胞系Hep一2的杀伤作用并研究其作用机制。研究方法：1．构建目的基因真核表达载体pcDNA3．1(+)矗NF一谨一IRES—CO、pcDNA3．1(+)／CD、pcDNA3．1(+)／TNF一0，并用酶切、PCR和DNA测序进行鉴定。2

5、。将以上各尽的基因真核表达载体及pcDNA3。1(+)空自覆粒在Lipofectamine2000介导下分别转染喉癌细胞Hep一2，G418筛选出抗性克隆并扩大培养，建立稳定表达株，分别命名为Hep一2／TIC、Hep一2／CD、Hep-2／TNF一程、Hep一2／0，RT—PCR检测各目的基因的表达。3。MTT法检测体外细胞杀伤作用。4．湃T法检测旁观者效应。5．流式细胞仪检测细胞凋亡率。6．用BALB／c裸鼠构建Hep一2／TIC、Hep一2／CD、Hep一2／TNF—a、Hep一2／0四组入喉鳞癌裸鼠皮下移植瘸模型。细胞接种的

6、第8天(移植瘤直径约5mm)开始，每天腹腔给予5一FC，连续12天。比较给药前后肿瘤体积变化、肿瘤倍增时间及抑瘤率，通过病理切片观察组织病理变化。中山大学硕士论文(2008)联合基因(CD和TNF．Q)治疗喉癌的实验研究7．统计学方法：采用SPSSl2．0统计软件。数据以均数±标准差(X±S)表示，用单因素方差分析，以P(O．05为差异有统计学意义。结果：1．目的基因真核表达载体的构建及细胞转染1．1目的基因真核表达载体pcDNA3．1(+)／CD、pcDNA3．1(+)／TNF—Q、pcDNA3．1(+)-TNF-Q—IRES-C

7、D构建成功，经酶切、PCR和DNA测序证实各插入基因及联合基因的大小、位置、方向均正确无误。1-2RT-PCR证明各重组外源基因在已转染目的基因真核表达载体的喉癌细胞系Hep-2中均有表达。2．体外实验2．1体外细胞杀伤实验Hep一2／TIC组的细胞杀伤作用最强，其杀伤作用呈浓度依赖性，与Hep一2／CD、Hep一2／TNF-Q、Hep一2／0组的差异均有显著性(f(O．05)。2．2体外旁观者效应Hep一2／TIC，Hep一2／CD组细胞均显示出明显的旁观者效应，其中以Hep一2／TIC组最明显，两组间的差异有显著性(P(O．05

8、)。而Hep一2／TNF—a和Hep一2／O组细胞未显示出旁观者效应。2．3细胞凋亡检测Hep一2／TIC、Hep一2／CD、Hep一2／TNF—Q、Hep一2／O四组细胞中以Hep-2／TIC组的凋亡率最高，四组两两之间比较差异均有