胃癌联合基因治疗的实验研究

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1、分类号VDC——博士学位论文密级胃癌联合基因治疗的实验研究StudyonCombinationGeneTherapyforGastricCancer作者姓名：学科专业：院、系(所)：指导教师：论文答辩日期埘2，．’7．“李佳内科学湘雅医院张桂英教授答辩委员会主席』趔中南大学2012年7月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作

2、的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：型学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：兰L导师签名：型生日期：旦年三月掣日博士学位论文中文摘要摘要背景与目的：胃癌是人类常见的恶性肿瘤之一，在全球范围，发病率居恶性肿瘤的第4位，病死率居恶

3、性肿瘤的第2位。长期以来包括手术切除及其他综合性治疗的应用，并没有带来满意的生存率。随着分子遗传学和分子生物学的发展及基因工程技术的进步，基因治疗已成为继手术、化疗、放疗之后的又一新的肿瘤治疗手段。胃癌的基因治疗在基础研究方面已取得了很大的进展，并显现出良好的临床应用前景。然而，临床实验提示单基因治疗恶性肿瘤效果有限，主要原因在于肿瘤的发生是复杂的多因素、多步骤、涉及多基因事件发生的过程，针对单一环节的转基因治疗常常不能达到满意的治疗效果。因此，向肿瘤细胞导入多种相关基因以形成叠加杀伤肿瘤细胞的效应，提高抗肿瘤效果是基因治疗的发展方向。随着分子生物学及

4、相关学科的进展，药物敏感基因疗法(即自杀基因疗法)显示了较好的应用前景，目前研究最深入且应用最广泛的是编码胸苷激酶的TK基因及编码胞嘧啶脱氨酶的CD基因。其中单纯疱疹病毒胸腺激酶(herpessimplex’virusthymidinekinase，HSV—TK)基因／苷昔洛韦(gancyclovir,GCV)系统与大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(Escherichiacolicytosinedeaminase，Ec．CD)基因／5．氟胞嘧啶(5．FC)系统是目前研究最深入、应用最早、最广泛本课题受以下基金项目资助：1．国家自然科学基金(No．30800518)

5、2．教育部博士点新教师基金(No．200805331090)博士学位论文中文摘要的自杀基因系统。单自杀基因治疗过程中，单自杀基因系统治疗存在着对肿瘤细胞类型的依赖性，且易引起肿瘤耐药性等不足。所谓联合基因就是利用基因工程技术将两种或多种自杀基因连接在一起，或将自杀基因与免疫基因联合应用。目前应用最广泛为CD．TK基因，兼具两种前药转化酶活性，使两类自杀基因产物协同作用，突破了对肿瘤细胞类型的依赖性，尽可能地消除了瘤细胞对药物的耐药性，而且尚可扩大肿瘤治疗谱，从而提高该疗法的实用性。恶性肿瘤的发生、发展及预后与细胞端粒酶的异常表达有密切关系。肿瘤端粒逆转

6、录酶(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)高表达，能够刺激细胞分化，抑制凋亡发生，最终导致细胞永生化。通过封闭或下调细胞hTERT表达，可致端粒缩短，影响染色体稳定性，表现为细胞生长受抑制和促进细胞凋亡，肿瘤恶性表型发生逆转。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是在mRNA水平上的基因阻断技术，可高效、特异抑制靶基因表达。临床资料显示：hTERT基因在胃癌组织的表达阳性率约为76％"-'86％。靶向hTERT基因的RNA干扰可有效下调hTERT在mRNA和蛋白水平表达，细胞增殖被抑制。因

7、此，本课题通过构建表达融合自杀基因yCDglyTK及hTERT-shRNA的联合基因表达载体，通过体外实验研究其抗胃癌作用，探讨联合应用自杀基因治疗与抗端粒逆转录酶基因疗法治疗胃癌的可行性及调控细胞凋亡的机制。方法：(1)选择有效靶序列并构建靶向hTERT的干扰质粒pYrl．1．hTERT-shRNA；采用PCR法从pYrl．1．hTERT-shRNA中扩增博士学位论文中文摘要shRNA表达框架，亚克隆至融合自杀基因载体pcDNA3．1(一)cv—yCDglyTK，构建联合基因质粒pcDNA3．1(．)．hTERT—shRNA／yCDglyTK；酶切、

8、测序等鉴定重组质粒；(2)以磷酸钙纳米颗粒(calciumphosphatenanoparti