FUT3靶向miRNA表达载体的构建及其在胃癌基因治疗中的实验研究

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1、FUT3靶向miRNA表达载体的构建及其在胃癌基因治疗中的实验研究FUT3靶向miRNA表达载体的构建及其在胃癌基因治疗中的实验研究专业：免疫学研究生：辛永红指导教师：汪运山(教授)中文摘要背景：多年研究发现Lewis血型抗原表达于消化道上皮组织表面并与幽门螺杆菌(HP)引起胃癌的发病机制密切相关。Lewis血型抗原中Le6可与HP的BabA特异结合，是HP粘附的主要受体之一。实验证明含Le6的可溶性糖蛋白或抗Le6的抗体能抑锘lJHp黏附于胃上皮细胞。Le6的表达受Le(FUT3)基因秀l：lSe(FUT2)基因的共

2、同调控，两种基因表达的变化会影响到Le“抗原的合成。本研究将从FUT3基因入手，以较高表达Lewis血型抗原的胃癌细胞系KAT0一III为研究对象，通过RNAi技术中的miRNA干涉d-1，3／4一岩藻糖基转移酶(flPFUT3酶，I主IFUT3基因编码)的合成和表达，研究其降低胃癌细胞Le6的表达从而抑制HP对胃上皮细胞的黏附的作用，并观察FUT3基因沉默对胃癌细胞的增殖和凋亡的影响。本课题的研究将有利于探讨肿瘤等重大疾病的发病机制，为肿瘤的靶向基因治疗提供新的思路和手段。目的：本研究旨在利用RNAi技术，构建FUT

3、3基因的miRNA干扰质粒pcDNA硼6．2一GW／EmGFP—FUT3一miR：通过体外试验探讨FUT3的miRNA干扰质粒抑制胃癌细胞系KATO—III的Lewis抗原表达及肿瘤细胞生长的作用机理，以期为胃癌治疗提供新的基因治疗手段，同时为获得FUT3基因的最佳miRNA序列应用于临床胃癌提供实验基础。．方法：1)选择2个符合条件的靶Ifi--JFUT3的miRNA序列，分别体外合成两段互补的寡核苷酸，与线性载体pcDNA瑚6．2一GW／EmGFP—miREXPRESSIONVECTOR连接；确定构建成功后，转染K

4、ATO—III细胞；2)将脂质体／质粒载体以不同剂量及浓度配比转染KATO—III细胞，荧光显微山东医学科学院硕士学位论文镜观察转染效率，筛选出最佳阳离子脂质体／质粒载体配比；3)质粒转染肿瘤细胞48小时后，RT-PCR法检测FUT3基因在mRNA水平的变化：应用免疫细胞化学法、流式细胞术检测Lewis抗原表达变化；筛选出FUT3的最佳miRNA序列。4)用筛选出的FUT3miRNA转染KATO—III细胞，MTT实验、流式细胞术(AnnexinV／PI双染色法)检汉WJFUT3基因的表达抑制对KATO—III细胞生长

5、的影响及诱导凋亡作用。结果：1)基因测序结果表明插入片段的序列与合成的FUT3寡核苷酸序列完全相符，即成功构建针对FUT3基因的pcDNA硼6．2一GW／EmGFP—FUT3一miR表达载体。2)筛选出最佳的阳离子脂质体／质粒载体转染复合物的配比为8ul：2pg。3)RT—PCR结果表明在mRNA水平上所构建的两个质粒都可抑制FUT3基因的表达；免疫细胞化学法、流式细胞术结果显示所构建的质粒均可抑制Le6抗原水平的表达。与空载体对照相比，pcDNATM6．2-FUT3一miRNA2LEpcDNAⅢ6．2一FUT3一mi

6、RNAI抑制效果更明显。4)MTT实验表明FUT3基因的表达减少能明显抑％lJKATO-III的生长；用流式细胞术(AnnexinV／PI双染色法)检测发现抑制了FUT3基因表达后，可诱导肿瘤细胞的凋亡。结论：本课题成功构建了针对人FUT3基因的miRNA干扰载体。实验证明，利用RNAi技术能有效地抑制KAT0一III胃癌细胞系FUT3基因mRNA的表达，并能降低该肿瘤细胞Lewis抗原的生物合成；FUT3基因miRNA干扰载体对KATO-III细胞的生长和凋亡也有不同程度的影响。本课题为探讨FIJT3基因在Lewis

7、抗原相关胃癌基因治疗方面的应用奠定了理论基础。关键词：FUT3；miRNA：KATO-III；RNAi；Lewis抗原2FUT3靶向miRNA表达载体的构建及其在胃癌基因治疗中的实验研究Const‘ofmiructlonofm1RNA乙OnSt删AexpresslonvectortargetingFUT3geneandtheexperimentalstudyofgenetherapyforBackgroud：gastriccarcinomaMajor：ImmunologyM．S．Candidate：XinYonghon

8、gTutor：WangYunshan(Professor)AbstractHumanbloodgroupLewisantigen，whichisalsoexpressedingastrointestinalmucosa，isakeypointinH．pylori’Scausedgastriccancer．sinceBabA—Leb