椎间盘退变higfi基因治疗的实验研究

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1、中山大学博士学位论文椎间盘退变hIGF-I基因治疗的实验研究姓名：黄宗强申请学位级别：博士专业：骨科学指导教师：刘尚礼20040423中山大学博士学位论文椎问盘退变hIGF．1摹凶治疗的实验研究椎问盘退变hlGF．I基因治疗的实验研究专业：骨科学博士生：黄宗强导师：刘尚礼教授中文摘要下腰痛(10wbackpain，LBP)是脊柱外科的常见病、多发病。资料表明：美国人一生中发生下腰疼的概率为60％～80％，在成人丧失劳动能力的原因中，下腰痛位居第三位。椎间盘退变(intervertebraldiskdegeneration，IVDD)为LBP的主

2、要病因。现今临床上对于IVDD引起的LBP多先采用保守治疗，对于通过正规保守治疗症状不能缓解的患者，采用手术治疗。应用最广泛的手术是椎间盘切除或／和脊柱融合术，可经各种手术入路(前路、后路、侧方入路及联合手术入路)及使用多种方法(自体骨、异体骨移植术、各种Cage和多种内固定器械的应用)手术治疗。近年来，这两类手术技术取得了长足的进步，微创外科技术的应用使创伤越来越小且确实、有效地缓解了症状。但是，减压术后必然导致椎间关节结构、形态、功能异常和不稳定，融合术后亦加速邻近节段的退变，远期优良率在70％左右，疗效并不理想。原因在于减压和融合的治疗方

3、法不能恢复和保持椎间关节的正常结构与生理功能，不能减缓IVDD的进程。它们是一种IVDD发展到后期引起严重LBP的对证治疗方法。为了寻找一种IVDD的理想治疗方法，近年来，学者们提出了椎间关节成形术。椎间关节成形术包括椎间盘置换术和椎间盘再生。椎间盘置换术已进入临床试用阶段，近期效果尚可，远期效果尚需要进一步随访。采用导入生长因子基因和／或炎症因子拮抗剂基因逆转或延缓IVDD的椎间盘再生成为近年实验研究的热点。人胰岛素样生长因子(humaninsulin-likegrowthfactor，hlGF．I)是一种由70个氨基酸组成的多肽，Mr=7．

4、6×103，其结构与胰岛素同源，受生长激素调节。文献报道hlGF-I生长因子在椎间盘中的作用有：①促进聚集蛋白多糖(aggrecan)合成，减慢aggrecan的降解，抑制基质金属蛋白酶表达。②逆转体外培养的椎间盘细胞调亡。③促进合成u型胶原蛋白。榷间盘退变hlGF．I基因治疗的实验研究嚣师：刘尚扎教授撼士生；装宗强探讨hlGF-I基因是否S％逆转绒延缓IVDD，本硬究制作撅题兰大巍兔IVDD攘型，梅建携带MGF-I舀酌基函的朦病毒载体(AdlCMV-hlGF-1)，体矫裣溯箕生物学活性，体内转染IVDD退变的椎间盘细胞进行hlGF-1基因治疗

5、。第一部分IVDD动物模黧的建立耳的；铡{乍腰雄失璁诱发的WDD动甥模型，为IVDD蠡冬hlGF-1基阂治疗的羹定萋稿。方法：48灵新西兰大自兔，雄往。分剐做骨性手术、软组织手术。骨性手术切除L4、L5的下关节突，保留L5、L6的上关节突，L4／5、L5／6援阈擞必实验缝挫闼盘，妫愆、L6／7椎阙盘淹垂巍对照缀榷阕盘。软组缆手术仅剥离L4～L6稚旁肌肉，L4，5、L5／6稚问盘为实验对照组椎间盘。术后1、2、4及8m，进行组织学、分予生物学检测观察椎间擞的变化。①组织学观察：取挂，行雄阈盘题状位、矢状位及横断位切片，HE、Masson三色进行光

6、学晨徽镜观察。稚闻盍横断面上胶原纤维、aggrecan的排列改交采用扫描电子显微镜观察；透射电予显微镜观察椎间盘中细胞、细胞器及细胞钋基质的变化。②分子生物学检测：取材，攫取等矮量椎阕盘标本瓣总RNA。采爝Prime5．0软件设计aggrecan、II登胶原及I疆胶原的引物。采用RT-PCR方法分别扩增三种目的綦因片段。用磷酸甘油醚脱氢酶(glyeeraldehydephosphatedehydrogenase，GAPDH)做为海参照分裂进行三穗基辫mRNA袈达半定量。实验数据蠲SPSS11．5软件包统计。绪采：术后2只死于髭部坏疯。①组织学梭

7、查：正常新西兰大自兔椎间盘胶原纤维相互编织平行排梦4，椎间盘细胞均匀蠢序地刳}列于胶器纾维之闽，呈图形或椭圆形。隧着术惑时闯延长，实验组椎阊盘逐渐出现髓核皱缩、裂变，酸性粘多糖减少，纤维环胶原变性、破裂。稚间盘细胞形状不规则，数量减少，线粒体、粗碰虑质劂肿胀，核浓续，核朕皱续。术屠8m，部分槛闼盘出现髓核缀织突入纤维环。②分子生物学检测：aggrecan、II麓胶原基闵片段凝胶电泳出现在200～300bp处；I型胶原出现在100～200bp处：GAPDH出现在500～600bp处，位置与理论僮毙全相同。在提固缝别内睫着拳蜃时闼怒长，aggree

8、an、娃型胶添mRNA的稻对表达量下降；褶简时期内，实验对照组最高，实验组最低。具有统计学意义(P