肌苷生产菌摇瓶发酵条件优化及代谢通量分析

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1、肌苷生产菌的摇瓶发酵条件优化及代谢通量分析摘要肌苷在食品和医药领域有着非常重要的用途：它是各种调味食品的营养助鲜剂，可以治疗冠心病、肝炎、白血球减少症等疾病，同时也是抗生素生产的原料。但是，近年来随着国外厂家对中国市场的冲击，国内的核苷发酵产业面临着严峻的挑战，为此提高发酵得率、降低生产成本，提高生产能力已经成为当务之急。本论文以实验室前期选育的枯草芽孢杆菌JMUKC2为研究对象，以肌苷产量为主要指标，初步优化了枯草芽孢杆菌JMUKC2生产肌苷的摇瓶发酵工艺；研究了不同促进剂对枯草芽孢杆菌JMUKC2积累肌苷的影响；并用代谢通量分析的方法解

2、释了不同促进剂的添加对肌苷生产菌JMUKC2摇瓶发酵积累肌苷的作用机理。从枯草芽孢杆菌JMUKC2产肌苷的摇瓶发酵培养基的基本成分及其发酵条件入手，利用单因素试验并结合正交试验对枯草芽孢杆菌JMUKC2的摇瓶发酵培养基及发酵条件进行了优化，并确定了其最佳摇瓶发酵培养基配方及最佳发酵条件。优化后的最佳摇瓶发酵培养基配方为：葡萄糖140g／L，酵母膏17g／L，玉米浆20g／L，尿素7g／L，硫酸铵20g／L，KH2P047g／L，MgS04·7H201g／L，CaC0320g／L。优化后的生物量和肌苷产量均比优化前有较大的提高：比初始培养基分

3、别提高了41％币H47％。优化后的最佳摇瓶发酵条件为：接种时间为18h，接种量为7％，装液量为15mL，发酵培养基的初始pH值为6．5，摇瓶发酵温度为37oC。枯草芽孢杆菌JMUKC2摇瓶发酵条件经过优化后，生物量和肌苷产量均比优化前有了较大的提高：比初始发酵条件分别提高了51％和222％。根据肌苷合成的不同调控机理，选择并研究了五种对菌体生长和肌苷积累均有促进作用的促进剂(柠檬酸钠、葡萄糖酸钙、氟化钠、次黄嘌呤及氯化钙)，且确定了其最适添加量，同时探讨了肌苷合成与菌体内蛋白质含量、核酸含量之间的关系。当复合添加这些不同组合的促进剂时，所得

4、肌苷产量比添加单一促进剂时的肌苷产量会有显著的提高，其中当同时添加0．15％次黄嘌呤、2mg／L氟化钠、10mg／L氯化钙及15g／L葡萄糖酸钙时，肌苷产量达到了14．01g／L，是对照组肌苷产量的4．39倍。基于物料的质量守恒定律和代谢反应中间代谢物的拟稳态假设，结合发酵过程曲线，初步研究了不同促进剂的添加对肌苷发酵过程不同时段(24h一32h，56h一64h，80一88h)代谢流分布的影响。结果表明，添加不同的促进剂可以引发枯草芽孢杆菌细胞内的代谢流迁移，增大肌苷合成途径的代谢通量，而组合添加促进剂对肌苷合成代谢流的促进效果具有叠加效应

5、。关键词枯草芽孢杆菌，肌苷，摇瓶发酵，促进剂，代谢通量分析OptimizationofFermentationConditionsandMetabolicFluxAnalysisofInosineProducingStrainAbstractInosineisallimportantflavorenhancerinthefoodindustry,aprecursorforantiviraldrugofcuringcoronaryheartdisease，hepatitisandleucopenia，andtherawmaterialofan

6、tibioticproductioninthemedicinefield．However,withtheimpactofforeignmanufacturesonourmarket，thedomesticnucleosidefermentationindustryfacesaseverechallengeinrecentyears．So，howtoenhanceinosineproductiveyieldhasbecomeatopprioritytoreducethecostofcommercialproducts．Aninosine—pr

7、oducingstrainBacillussubtilisJMUKC2wasscreenedfromBacillussubtilisCICC20958bythemethodofultravioletmutagenesisintheearlierresearch．Inordertoincreaseitsinosineproduction，thetechnologyofshaking-flaskfermentationwasoptimizedandtheeffectsofdifferentadditivesoninosineaccumulati

8、onforBacillussubtilisJMUKC2werestudiedinthepaper．Inaddition，thewholemetabolicprocessofino