肺癌转移相关蛋白1(lcmr1)相互作用蛋白的筛选与鉴定

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2、军医进修学院研究生学位论文原创性声明秉承我院“敬业、勤奋、求实、创新’’的学风，本人声明：所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得我院或其他教育机构的学位及证书而使用过的材料，对本文的研究作出贡献的个人或集体，均已在文中做了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：指导教师签名：：加【0军g-日fg日：3-olo卑}闰f8J丑研究生学位论文版权使用授权书本人保证毕业离院

3、后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为军医进修学院或解放军总医院。学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文原件、复印件和电子版本，可以采用影印、缩印、扫描或其它手段保存论文以供被查阅和借阅。学院可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)。论文作者签名指导教师签名期：≯o(o绎}目f8日期：2ofo年岁f丑lg日●_目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(1)英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(3)前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(5)翮看⋯“⋯“⋯⋯⋯⋯“⋯“⋯⋯⋯“⋯⋯“⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯”⋯⋯。(5．)第一部分酵母双杂交技术筛选LCMRI相互作用蛋白第一节诱饵质粒的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(8)第二节95D细胞cDNA文库的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(23)第三节共转化实验及阳性克隆的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(30)第二部分蛋白相互作用的细胞内验证第一节标签质粒的构建与鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(39)第二节标签质粒共转染细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(51)第三节免疫共沉淀反应及WesternBlot检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(58)第三部分蛋白相互作用的体外验证第一节诱饵质粒

5、的原核表达与纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(67)第二节捕获蛋白的体外转录翻译⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(74)第三节GST融合蛋白沉降反应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(79)结论⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯·⋯⋯⋯⋯(87)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(88)文献综述蛋白质相互作用的研究策略⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(92)英文缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(100)攻读学位期间发表文章情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(101)致谢⋯···一·：⋯·⋯··⋯⋯

6、···⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯“·⋯·⋯·····(102)●．-肺癌转移相关蛋白l(LCMRl)相互作用蛋白的筛选及鉴定中文摘要目的：肺癌转移相关蛋白1(1ungcancermetastasisrelatedprotein1，LCMRI)的编码基因是我们实验室采用差异显示技术克隆到的新基因(GenBankID：AYl48462)，目前其生物学功能不明确。本实验拟通过蛋白一蛋白相互作用研究，寻找与LCMRl相互作用的蛋白，为进一步研究LCMRl基因的功能及其在肺癌发生、发展中的作用提供线索和分子基础。方法：(1)将诱饵质粒pGBKT7-LCMRl转化入酵母菌，检

7、测诱饵质粒有无转录激活活性和宿主毒性，鉴定BD-LCMRI融合蛋白的表达情况。(2)以95D细胞总RNA为模板，采用SMART技术在逆转录酶的作用下合成eDNA第一链，使用长距离PCR扩增dscDNA片段．(3)将诱饵质粒pGBKT7-LCMRI、95D细胞eDNA文库片段及线性化质粒pGADT7-Ree共转化酵母菌AHl09，用营养缺陷型培养基初步筛选阳性克隆．(4)通过反复划线培养及重复检测报告基因激活等方法，去除假阳性克隆。(5)提取阳性克隆质粒，分离并扩增单个文库质粒。将pGBKT7-LCMRI诱饵质粒和单个文库质粒共转化酵母菌AHl09，验证其相互作用

8、。(6)回复验证为阳性的质粒测序并进行生物信息学分析．(7)应用免疫共沉淀(CO-IP)技术在细胞内对酵母双杂交结果进行验证，确认蛋白质相互作用。(8)应用融合蛋白沉降(GSTpul卜down)技术在体外对其结果进一步验证，确定蛋白质相互作用．结果：(1)诱饵质粒pGBKT7-LCMRl测序鉴定正确，经检测诱饵质粒无自激活作用和宿主毒性，Westernblot实验证实诱饵质粒可在酵母中正确表达融合蛋白BD-LCMRI。(2)以95D细胞总RNA为模板合成dseDNA，产物纯化后痉1．2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，观察到一条明亮的弥散状条带，大小在250bp一6000b

9、p，符合文库构建要求。(