采用定量蛋白质组学技术筛选小鼠肝癌淋巴道转移相关蛋白

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1、独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：歪j!鱼鍪签字目期：2翌2年_上月卫目I，／学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子

2、版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。论文作者签名：至!1．!盛鍪指导教师签名：么趁丛!签字日期：兰竺砗舅』采用定量蛋白质组学技术筛选小鼠肝癌淋巴道转移相关蛋白博士研究生：孙成荣指导教师：唐建武教授专业名称：病理学与病理生理学摘要背景：浸润性生长和转移潜能是恶性肿瘤不同于良性肿瘤的根本特征，是恶性肿瘤顽固性和难治性的根本原因。由转移所导致的恶性肿瘤患者死亡率高、预后差及其发生机制不清，长期以来一直是肿瘤学研究面临的难题之一。由

3、上皮来源的恶性肿瘤，淋巴道转移是其早期转移的主要方式，因此对于淋巴道转移机制进行研究，发现淋巴道转移关键分子机制和通路，并建立起一套行之有效的针对性阻遏手段，将对恶性肿瘤患者具有重要的现实意义．。Hca．F和Hca．P是～对来源于同一亲本细胞、且淋巴道转移潜能显著不同的小鼠肝癌腹水型细胞株，其中Hca．F为高淋巴道转移力细胞株(>70％)，Hca．P为低淋巴道转移力细胞株(<30％)，二者在肿瘤淋巴道转移机制研究中互为参照，是难得而有效的细胞模型。我们已应用基因芯片等高通量技术手段，在mRNA水平对Hca．F细胞株和Hca．P细胞株进行研究，

4、发现二者有明显差异的基因表达。但是从mRNA水平进行研究，只包括了转录水平的调控，不但在丰度上不能反应蛋白质的表达水平，而且蛋白质复杂的翻译后修饰、亚细胞定位和迁移、-蛋白质和蛋白质的相互作用等，也几乎无法从mRNA水平来判断。蛋白质是生理功．能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质的研究将直接阐明生命在生理和病理条件下的变化机制。蛋白质组学是对一个细胞或组织的基因组所包含的全部蛋白质进行的研究。但由于技术方法限制及蛋白质表达的时空差异，很难分离和得到表达的所有蛋白。因此发展可靠高通量的技术手段，将会推进对蛋白质组的研究。为实现这一目标，

5、以双向凝胶电泳和质谱为基础的蛋白质组学分离和鉴定技术迅速发展起来。目的：本研究应用近年来发展起来的定量蛋白质组学技术一荧光差异双向凝胶电泳，在蛋白质水平对高、低淋巴道转移力小鼠肝癌腹水型细胞株Hca—F和Hca—P基因表达进行比较研究，建立相应的荧光差异双向凝胶电泳蛋白表达图谱，并对有统计学意义的差异性蛋白质点进行质谱分析，以筛选肝癌淋巴道转移相关蛋白，为进一步阐明淋巴道转移的分子机制奠定基础。方法：将冻存的Hca—F与Hca—P细胞株复苏后，进行细胞培养。以动物实验观察二者在615小鼠的淋巴结转移率。提取总蛋白的瘤细胞洗涤后，冷冻离心机离心

6、，取沉淀加入细胞裂解液，并在冰浴下超声破碎。冷冻离心机离心后，提取上清。采用蛋白定量标准试剂盒，测定样品蛋白浓度。蛋白的荧光标电按照厂家介绍的步骤进行，Cy3(Cy5)染料分别交叉标记Hca—F(Hca—P)细胞提取的蛋白，Cy2染料标记总量相同，但Hca．F细胞和Hca．P细胞各1／2量蛋白。与缓冲液及IPG泡涨液混合，制成一向等电聚焦体系。在该体系中重泡涨IPG干胶条10个小时后，按照操作说明使用IPGphII电泳仪，以50mA电流等电聚焦76KVh。等电聚焦结束的IPG胶条平衡后，进行12．5％SDS—PAGE电泳。双向凝胶电泳结束后，

7、应用Typhoon⋯9400成像系统扫描成像。采用DeCyder软件DIA和BVA模式，进行凝胶图像分析。不同凝胶内分析模式采用配对比较，以Cy2为内标计算比值，通过Cy3／Cy2及Cy5／Cy2的比率对应每个蛋白点含量，并对其进行标准化计算。重复4块胶用来计算每个蛋白点平均量的改变，并进行t检验，计算P值，设定P

8、。以蛋白质印迹验证差异蛋白质Erp29和UCHL3的表达水平。对鉴定出的差异性蛋白质进行生物信息学的功能分析，所使用的分析系统为DAVID和PANTHER，分别从蛋