牛结核分枝杆菌ag85b基因的克隆表达与elisa检测方法的初步建立

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1、摘要牛结核病主要是由牛分枝杆菌(Mycobacteriumboris)弓l起的一种人兽共患的慢性、消耗性传染病。牛结核病原菌可以感染入和多种动物，其中，牛是最易感的动物特别是奶牛。人类与牛的关系较为密切，据调查10％以上的人结核瘸是由牛分枝杆菌引起的，因此牛分枝杆菌是人结核病的重要病原，所以掌握和应用离敏感、高准确率的牛结核检疫方法是防止患结核病牛的半分棱杆菌感染人类的重要手段之一。本试验根据GenBank公布的牛分枝杆菌AF2122／97(检索号NC002945)株的A985B基因序列设计引物，

2、以牛分枝杆菌ValleeIll基因组DNA为模板利用PCR方法扩增牛分枝杆菌A985B基因，把A985B基因克隆于pET-32a(+)原核表达载体上，经测亭帮EcoRl和K≯娃l双酶切鉴定，获得豳性重组质粒pET32．A985B，将阳性重组质粒pET32．A985B转化到BL21感受态细胞中用IPTG进行诱导表达，经SDS．淞G譬和Western．Blot检测分睾厅，表鞠蛋白成功表达，丽且能够与孛结核阳性血清反应，经His．bind柱子纯化后获得纯度较高的A985B蛋白。同时本试验以纯化的A985

3、B蛋囱隽毽被抗琢，初步建立A985B．ELISA，对其包被浓度、血清稀释度、封闭液、及底物作用时间等方面进行选择和优化，而且对A985B．ELISA与PPD．ELISA方法在符合性、敏感性和特异性方面进行比较，结果显示A985B—ELISA特异性高于PPD．ELISA，丽PPD．ELISA的敏感性高于A985B．ELISA，由于实验动物较少二者的符合性差别不明显。关键词：牛分枝杆菌；A985B：克隆；表达；PPD；ELISAExpressionofA985BgeneofMycobacteriumB

4、ovisAndDevelopmentofIndirectELotIndirectISAlSAAbstractBovinetuberculosis(BDisachronicwastingdiseaseprimarycausedbyMycobacteriumbovisthatcallinfecthumanandalotofanimal，bovineistheanimalofthemostsensitive，especiallytheCOW．Accordingtotheinvestigation,mor

5、ethan10％humantuberculosisarearousedbybovinetuberculosis，thereforeMycobacteriumbovisistheimportantdiseasesourceofhumantuberculosis，SOwegetholdofthequarantinemethodofhighsensitiveandhi曲accuracyrateistopreventpeopleinfecttheMycobacteriumbovis．Inthispaper

6、,A985BgeneofMycobacteriumBovisisexpressedandindirectELISAisdevelopedtodetectbovinetuberculosis．WeaccordingtotheA985BgenesequencepublishedinGeneBankofAF2122／97strain,primersweredesigned，theDNAfragmentofA985BgeneWasamplifiedbyPCRfromMycobacteriumbovisVa

7、lleeIII，thepurityproductwasclonedinitiallyintoPMD18-T．thenpositivecolonyWaschoosedandsequencedandthefragmentswereinsertedintotheorientationofthevectorpET-32a(+)，byWestern—Blotdetection，theproteinWashavebeenexpressedsuccessfully,Expressedproteinofhi曲pu

8、ritywerepurifiedbyHis—bindchromatographyatlast．InthisexperimentationwealsosetupA985B—ELISAprocedurewithpurifiedA985Bproteinascoatingantigen，thenwechoosethebestconditionforourexperimentationsuchasdiluentsforserum，blockingbuffer，incubationtimefo