新孢子虫srs2基因的克隆、表达及elisa方法的建立

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1、甘肃农业大学2009届硕上学位论文摘要摘要新孢子虫(Neosporacaninum)是一种专性细胞内寄生的原虫，主要引起牛、狗等动物的神经肌肉性疾病和流产，尤其是奶牛的流产，严重影响养牛业的发展。新孢子虫病的早期诊断是有效控制该病发生和蔓延的重要手段。研究表明，新孢子虫表面蛋白NeSRS2具有较好的免疫原性，是新孢子虫病诊断和疫苗研究的重要候选抗原。本试验拟采用新孢子虫表面蛋白NcSRS2建立间接ELISA诊断方法，用于牛新孢子虫病诊断。参考GenBank登录的新孢子虫NcSRS2全基因序列，在163"

2、"1141处设计一对引物，通过PCR扩增出NeSRS2的相应片段，构建T-A克隆，经PCR鉴定、酶切鉴定和测序分析后，再亚克隆到表达载体pET-32a中，构建了重组质粒pET-32a-NcSRS2t，转化DH5a感受态细胞，经PCR扩增和酶切鉴定后，保存重组质粒。将重组质粒pET-32a-SRS2t转化表达菌BL21，用IPTG诱导表达融合蛋白NeSRS2t。Westernbloaing检测，表达的融合蛋白NcSRS2t能够被新孢子虫阳性血清所识别。将表达的融合蛋白NcSRS2t收集、纯化后作为抗原，包

3、被聚苯乙烯微量反应板，初步建立检测牛新孢子虫抗体的间接ELISA。试验结果表明，重组蛋白的最佳包被浓度为51xg／ml，最佳封闭时间为2h，检测血清稀释度为1：200，抗原和抗体作用时间为lh，HRP标记的兔抗牛IgG的工作浓度为1：5000，最佳显色时间为10min，用2mol／LH2S04为终止液，确定阴阳性的临界OD值为0．275。关键词：新孢子虫；SRS2；原核表达；间接ELISA甘肃农业大学2009届硕士学位论文Summary．-Neosporacaninumisoneofintracellu

4、larprotozoanparasitewhichisresponsibeforneuromusculardiseaseandabortioninearle，dogsandotheranimals，especially,abortionofcowearle，whichhasbroughtaboutenormouseconomiclossforthelivestockfarming．Earlydiagnosisisimportantforcontrollingneosporosis．Ithasbeensh

5、ownmatNcSRS2，themajorsurfaceantigenofNeosporacaninumisahighlyimmunogenicproteinandanappropriateantigenfordevelopmentintoacaceine．Therefore，NcSRS2waschosenasthesurfaceproteinfordevelopmentofindirectELISAinneosporosisfordiagnosisincattle．AccordingtoNcSRS2g

6、enesequenceofNeosporacaninum，twopairsofprimersweredesignedandsynthesized，whichwereusedtoamplifythefragmentsofNcSRS2gene、析nlPCRinthel63～1141，andthenthecorrespondingT／Acloneswereconstructedwitllthepartfragments．PCRamplificationandenzymedigestionafteridenti

7、fyingthefragment，thenthefragmentwassequencedandsubclonedintopET-32aplasmid，thentransformedintosusceptibleE．coliDH5a．ThepositivecloneswereselecteefromtheampicillinpositiveLBplateafteridentificationbyPCRandenzymedigestion．Theexpressionofthetargetgeneswasin

8、ducedwithlmmol／LIPTGafteralltherecombinantplasmidswereidentifiedandtransformedintothecompetentcellsofthehostcellE．coliBL21．ThefusionproteinNcSRS2twasexpressed．TheexpressedproteincouldbereactedwitllantibodiesofN．caninumbywe