梅花鹿感染犬新孢子虫双抗夹心dot-elisa检测方法的建立及应用

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1、本研究得到“国家重点基础研究发展计划（973计划）”（编号：2015CB150300）、吉林省科技发展计划项目（资助号20130521005JH）、吉林省长白山学者和国家质检公益性行业专项（201410061）资助Theprojectsupportwasprovidedbythe“NationalKeyBasicResearchProgram(973Program)ofChina”(GrantNo.2015CB150300),DepartmentofJilinprovincialScienceandTechnology(20130521005JH)，ChangbaiMounta

2、inscholarsofJilinProvinceandtheSpecialFundforQualityDetectionResearchinthePublicInterestinChinaIII中文摘要梅花鹿感染犬新孢子虫双抗夹心Dot-ELISA检测方法的建立及应用犬新孢子虫（Neosporacaninum,N.caninum）于1984年在欧洲被首次发现，为细胞内寄生虫。新孢子虫的终末宿主为犬，中间宿主为奶牛、绵羊、山羊、牛、马、鹿等动物；虫体的寄生部位是宿主的中枢神经系统、肌肉、肝、脑及其他内脏组织；临床上可引起奶牛等孕畜流产及新生幼畜神经系统疾病等，给畜牧业造成严重的

3、经济损失。然而目前尚无效果显著的药物来治疗该病，所以灵敏特异的临床诊断方法成为了防治该病的重点。据报道新孢子虫可感染特种经济动物—鹿，对鹿的健康和相关产品造成影响，目前没有针对鹿感染犬新孢子虫的诊断方法。因此，本研究利用新孢子虫MIC6蛋白制备单克隆抗体，建立检测梅花鹿感染犬新孢子虫的双抗夹心Dot-ELISA诊断方法；从而为深入研究梅花鹿感染犬新孢子虫防治奠定基础。1、新孢子虫MIC6单克隆抗体的制备：本研究的免疫抗原为新孢子虫的pGEX-MIC6重组蛋白，利用该抗原对BALB/c小鼠进行免疫，取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，经克隆筛选获得两株杂交瘤细胞株，分别命名为1A1和

4、1H11，染色体数目分别为90条和94条，经亚类鉴定1A1为IgG1，1H11为IgG2b。先后采用辛酸－饱和硫酸铵法和亲和层析45法纯化抗体，腹水效价测定结果发现1A1和1H11效价分别为5.12×10和1.024×10，浓度分别为0.974mg/mL和2.01mg/mL。特异性试验发现这两株单抗不仅能特异性识别新孢子虫，还与弓形虫无交叉反应。2、新孢子虫MIC6蛋白抗原定位：利用免疫荧光技术，通过共聚焦激光扫描荧光显微镜对新孢子虫MIC6蛋白抗原进行了定位，发现该蛋白定位于新孢子虫速殖子前端。3、梅花鹿人工感染犬新孢子虫的试验：本研究利用人工感染试验使梅花鹿感染犬新孢子虫，

5、观察其临床症状、病理组织变化并进行免疫组织化学检测，结果发现接种新孢子虫体后鹿出现体温升高，精神沉郁，厌食；剖检观察发现肝脏淤血肿大，表面有白斑；肺脏有局灶性暗红色病灶；脑膜淤血、水肿。对组织器官进行HE染色和免疫组织化学试验后发现，肝细胞发生变性坏死；肾小球系膜细胞增生；心肌细胞颗粒变性等，脑组织内发现有包囊，但其它组织中未观察到包囊样结构。检测接种新孢子虫后鹿血清中循环抗原，结果发现循环抗原的量呈先上升后下降趋势。4、梅花鹿感染犬新孢子虫双抗夹心Dot-ELISA检测方法的建立及应用：利用抗新孢子虫MIC6单克隆抗体，建立了检测梅花鹿感染犬新孢子虫双抗夹心Dot-ELISA

6、的方法，建立VI了其结果判定标准，经过一系列试验测定确定最佳反应条件为：HRP标记抗体稀释比例为1:100，包被抗体最适浓度为0.3μg/片，被检血清最合适的稀释比例为1:8。特异性、敏感性、重复性、灵敏度试验结果表明建立的方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和灵敏度。同时利用该方法和双抗夹心ELISA方法对长春地区某鹿场鹿79份血清样品同时进行检测，结果表明阳性率均为15.2%（12/79）。从而为梅花鹿感染犬新孢子虫的检测提供了新方法。关键词：犬新孢子虫，MIC6，单克隆抗体，双抗夹心Dot-ELISA，梅花鹿，感染，抗原定位VIIAbstractEstablishment

7、andapplicationofdouble-antibodysandwichDot-ELISAmethodforNeosporacaninuminfectioninsikadeerNeosporacaninumisanintracellularobligateprotozoarecognizedin1984andfirstlyreportedinEurope.Dogs,cows,sheep,goats,cattle,horses,deerandotheranimalsweremainlyi