牛新孢子虫抗体Dot-ELISA检测方法的建立.pdf

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1、ChineseJournalofVeterinaryMedicine中国兽医杂志2010年(第46卷)第5期25牛新孢子虫抗体Dot—ELISA检测方法的建立贾立军，张守发(延边大学农学院动物医学系，吉林龙井133400)中图分类号：$852．723文献标识码：B文章编号：0529—6005(2010)05—0025—02新孢子虫病(Neosporiasis)是由犬新孢子虫1．4Dot—ELISA程序和最佳反应条件的确定(Neospracaninum)寄生于犬、牛、羊等多种哺乳动1．4．1最适抗原包被浓度的确定在硝酸纤维素物细胞内而引起的一种原虫病_1]。该病主要引起膜光面上划4×4mm的方

2、格，切成10×4个格的大母畜的流产、死胎或新生胎儿的运动障碍和神经系膜片，于蒸馏水中浸泡5min后，取出置室温或统等症状，该病对牛的危害尤为严重，可垂直传播，37℃干燥。用碳酸盐缓冲液(0．1mol／L，pH9．6)带虫母牛可将虫体直接传给新生犊牛，已证实该病稀释抗原，按5#g／mL、10／~g／mL、20／,g／mL、40是造成养牛业严重经济损失的一个重要原因]。虽／,g／mL、80／,g／mL进行稀释，分别取lL点于每然国内建立了多种血清学诊断方法，但血清学诊断一个小方格的正中央，置室温或37℃干燥，将干燥用抗原均为重组蛋白，其敏感性、特异性将会受到不好的抗原膜片浸于封闭液中，37℃封闭

3、30min。取同程度的影响。因此，针对上述问题，本试验对出干燥后，将抗原膜片切成小片，放入微量反应板的新孢子虫虫体抗原进行了分析，并应用特异性虫体小孔中，点样面朝上。将阳性、阴性血清1：100稀抗原建立特异、敏感、稳定的Dot—ELISA血清学诊释后每孔加50L，37℃感作30rain。用PBS(0．1断方法，旨在为今后新孢子虫病的诊断和预防等研mol／L，pH7．2)洗3次。加入辣根过氧化物酶标记究奠定基础。的羊抗牛IgG5OL，37℃感作30rain。用PBS洗1材料与方法3次。每孔加入5OL显色液(二氨基联苯胺5mg／1．1材料新孢子虫Nc一1株、ICT试纸条均由日lOmL，H2o21

4、0uL／10mL，PH7．5)37℃显色，当阳本带广畜产大学原虫病研究中心惠赠；RPMI一1640性血清的抗原小片上呈现深棕色或浅棕色斑点，而培养基购自北京华美转导科技有限公司；犊牛血清阴性血清的抗原小片尚未呈现斑点时甩尽底物液，购自北京元亨圣马生物工程公司；非洲绿猴肾细胞加双蒸馏水终止反应，确定最佳抗原量。(Vero)由延边大学农学院预防兽医学实验室保存；1．4．2血清工作浓度的确定将阳性血清及阴性牛血清样本采自延边地区某养牛场；其他材料由延血清按50、100、200、400倍稀释，进行Dot—ELISA，边大学农学院预防兽医学实验室提供。确定血清工作浓度。1．2新孢子虫的体外培养及分离将

5、冻存复苏的1．5特异性试验新孢子虫Nc一1株接种到已长成单层的Vero细胞1．5．1阻断试验将牛新孢子虫病阳性血清、阴性培养瓶中，在37℃，5A0CO：浓度，饱和湿度条件下血清倍比稀释后，加入适量的抗原液，于37℃感作1进行培养，隔天换液，每天用倒置显微镜观察支撑细h，然后Dot—ELISA检测其抗体滴度，同时以未作任胞和新孢子虫的形态。按常规寄生虫培养方法传代何处理的阳性血清作对照。培养3代，然后应用27号针头分离在Vero细胞上1．5．2交叉反应试验用牛新孢子虫病阳性血清培养的新孢子虫，收集虫体一2O℃冰箱保存备用。及阴性血清、弓形虫阳性血清、牛瑟氏泰勒虫阳性血1．3新孢子虫抗原的制备及

6、特异性分析将最终清进行Dot—ELISA检测，重复2次。收集的新孢子虫置一2O℃冰箱中反复冻融、超声波1．6重复性试验将牛新孢子虫病阳性及阴性血粉碎处理后，以2000r／min离心10min，收集上清清1：100稀释后，用不同批次的抗原片进行Dot—液，即为新孢子虫抗原。将收集的抗原于透析袋浓ELISA检测，重复4次。缩后，用UV一754型紫外分光光度计测定蛋白浓度。1．7Dot—ELISA与ICT检测结果的比较应用建采用SDS—PAGE及Westernblot对新孢子虫抗原立的Dot—ELISA对30头份被检血清样本进行检进行分析，找出具有较好反应原性的抗原。测，同时进行ICT检测j。2结

7、果收稿日期：200907—282．1新孢子虫抗原蛋白浓度的测定制备的新孢作者简介：贾立军(1978一)，男，讲师，博士，主要从事分子免疫学研究，Email：lijunjial015@sohu．corn子虫抗原测定的蛋白质浓度为0．80mg／mL。26中国兽医杂志2010年(第46卷)第5期ChineseJournalofVeterinaryMedicine2．2新孢子虫抗原的特异性分析新孢子虫可溶ELISA检