DB22T 2559-2016 牛新孢子虫病检测方法LAMP法

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1、ICS11.220B41备案号：54236-2017DB22吉林省地方标准DB22/T2559—2016牛新孢子虫病检测方法LAMP法LAMPassayfordetectionofbovineNeosporaosis2016-12-09发布2017-03-01实施吉林省质量技术监督局发布DB22/T2559—2016前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：延边大学、吉林省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：贾立军、柴方红、张守发

2、、梁晚枫。IDB22/T2559—2016牛新孢子虫病检测方法LAMP法1范围本标准规定了牛新孢子虫病LAMP检测方法的技术要求。本标准适用于牛新孢子虫病病原检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1新孢子虫病Neosporiasis由犬新孢子虫(Neosporacaninum)引起的多种动物的一种原虫病，该病

3、主要引起母畜的流产、死胎或新生胎儿的运动障碍和神经系统疾病。3.2环介导等温扩增(LAMP)Loop-mediatedisothermalamplification针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件下(63℃左右)保温30min～60min，使得链置换DNA合成在不停地自我循环，即而完成的核酸扩增反应。4试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。4.1常规试剂4.1.1100mg/mL溶菌酶见附录A.1。4.1.210mg/mL蛋白酶K见附录A

4、.2。4.1.310%十二烷基磺酸钠见附录A.3。4.1.45%十六烷基三甲基溴化铵见附录A.4。4.1.5TE（pH8.0）见附录A.5。4.1.650×TAE缓冲液见附录A.6。4.1.7加样缓冲液见附录A.7。4.1.81.5%琼脂糖凝胶的制备见附录A.8。4.2分子生物学试剂1DB22/T2559—2016BstDNAPolymerase、SYBRGreenⅠ、限制性内切酶TaqⅡ、组织DNA提取试剂盒、血液DNA提取试剂盒、溴化乙锭、DNAMarker分子量标准等。使用或稀释时均参照试剂说明书进行。4.3引物表1LAMP特

5、异性引物序列及浓度引物引物序列引物浓度F3ATGCTTGTGTGGTGAGGC0.2µmol/LB3CAAGTGCCACCCACTGATC0.2µmol/LFIPCGCTGACCGATCGGTTAACTGATTGCCAAACTCAGTGCGT1.6µmol/LBIPTTAGCAGTTGGGGTGTCGGGTACCCTGTTTCGGGAGACA1.6µmol/L4.4标准阳性、阴性对照4.4.1标准阳性样品为犬新孢子虫基因组DNA提取物，DNA浓度为10mg～30mg。制备方法见附录B。4.4.2标准阴性样品健康牛组织DNA提取物，D

6、NA浓度为10mg～30mg。5仪器设备5.1低温高速离心机（12000g以上）。5.2恒温水浴锅（室温～100℃）5.3分析天平（感量0.1mg）5.4电泳槽（水平电泳槽）5.5电泳仪（电压1～300V；电流1～400mA）5.6凝胶成像系统（带紫外灯）5.7微量加样器（单道2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）5.8其它分子生物学实验设备（振荡器、小型离心机等）6试验步骤6.1样品采集无菌采集流产胎牛脑、肝、脾、肺等组织样品，或牛的血液样品，置灭菌1.5mL塑料离心管中，进行样品处理；或冷冻保存，备用

7、。6.2样品处理待检样品组织DNA或血液DNA的提取，按试剂盒说明书进行。6.3LAMP反应LAMP反应体系：总体系25µL。同时设置阳性对照、阴性对照和水对照。LAMP反应条件：63℃反应60min，80℃2min终止反应。2DB22/T2559—2016表2LAMP反应体系加样物浓度体积DNA模板10～30mg2µLMgSO46.0mmol/L3µLdNTP1.4mmol/L3.5µLF30.2µmol/L1µLB30.2µmol/L1µLFIP1.6µmol/L1µLBIP1.6µmol/L1µLBstDNAPolymeras

8、eBuffer10×2.5µLBstDNAPolymerase8U/µL1µLddH2O9µL总体系25µL6.4结果判定6.4.1眼观判定×将样品反应物加入1000SYBRGreenI2µL，室温放置10min，置于凝胶成像仪的紫外